华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因克隆和组织表达研究

发布时间：2020-11-16 18:12

　　 华山松大小蠹(Dendroctonus armandi Tsai et Li),主要分布于我国秦岭巴山林区,是危害华山松(Pinus armandi Franch)的主要蛀干害虫,其主要选择危害树龄30年以上的健康华山松,给秦岭巴山林区的生态系统带来巨大损失,严重地影响了该区域的生态环境健康和林业可持续发展。研究表明西部松小蠹诱剂(exo-brevicomin)在大小蠹信息素合成中起重要作用,并受保幼激素及喂食诱导调节。因此,研究大小蠹exo-brevicomin路径相关基因在不同时期、不同组织和不同处理条件的表达水平,对揭示大小蠹信息素的合成具有具有十分重要的价值和意义。应用RACE和qRT-PCR等分子生物学技术,研究华山松大小蠹(Z)-6-壬烯-2-醇脱氢酶(ZnoDH)和CYP6CR1基因在不同时期、组织和不同处理下的表达,取得以下研究结果:1.通过同源克隆,获得华山松大小蠹exo-brevicomin路径CYP6CR1基因序列全长,为1769 bp,经氨基酸序列相似度比较分析,确定为P450家族基因;获得华山松大小蠹exo-brevicomin路径ZnoDH基因序列片段,确定为SDR家族基因,片段长度为566 bp。2.华山松大小蠹CYP6CR1基因分子质量为146.93 kDa,编码507个氨基酸,等电点为5.00。3.华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因在不同发育期表达差异显著(p0.01),其中蛹期表达量最高,完全羽化成虫期和入侵成虫期表达差异显著。4.华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因在不同组织和雌雄成虫间的表达量差异显著(p0.01),雌雄成虫在后肠表达量最高;雌性成虫CYP6CR1在脂肪体中的表达量高于雄性成虫,而ZnoDH则在雌性成虫前中肠的表达量高于雄性成虫;CYP6CR1和ZnoDH在其余各组织中的表达量均为雄性成虫高于雌性成虫。5.华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因在不同时间保幼激素处理条件下差异显著(p0.05),2个基因的表达量随保幼激素处理时间的延长而增加,到达最大表达量后逐渐降低,36 h时CYP6CR1基因在雄性成虫中的表达量高于雌性成虫,而在其它时间雄性成虫的表达量低于雌性成虫。6.华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因表达量随喂食时间的延长而降低,到达最低表达量后逐渐回升;华山松大小蠹雄性成虫CYP6CR1和ZnoDH基因在不同喂食时间表达量差异显著(p0.05),雄性成虫在不同时间的表达量均高于雌性成虫。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S763.7
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 华山松大小蠹研究概况
        1.1.1 小蠹的种类及其分布
        1.1.2 主要大小蠹种类和分布
        1.1.3 华山松大小蠹生物学特性及相关研究
    1.2 信息素研究概况
        1.2.1 昆虫信息素
        1.2.2 大小蠹化学信息素
    1.3 昆虫信息素exo-brevicomin合成路径研究概况
        1.3.1 exo-brevicomin合成途径研究
        1.3.2 exo-brevicomin路径相关酶基因
    1.4 研究的目的和意义
        1.4.1 研究的目的和意义
        1.4.2 研究内容
第二章 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因的克隆
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
            2.1.1.1 采样地概况和供试昆虫采集
            2.1.1.2 主要试剂
            2.1.1.3 主要试验仪器
        2.1.2 试验方法
            2.1.2.1 华山松大小蠹总RNA提取
            2.1.2.2 cDNA第一链合成
            2.1.2.3 引物的设计及合成
        2.1.3 基因保守片段的获取
            2.1.3.1 CYP6CR1和ZnoDH基因保守片段的扩增
            2.1.3.2 CYP6CR1和ZnoDH基因保守片段的纯化回收
            2.1.3.3 CYP6CR1和ZnoDH基因保守片段的连接与转化
            2.1.3.4 CYP6CR1和ZnoDH基因保守片段的阳性克隆筛选与检测
        2.1.4 基因全长的获取
            2.1.4.1 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因全长模板的准备
            2.1.4.2 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因RACE引物的设计与合成
            2.1.4.3 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因5′和3′的扩增
    2.2 试验结果与分析
        2.2.1 CYP6CR1 基因全长序列
        2.2.2 ZnoDH基因片段
第三章 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因的生物信息学分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 试验方法
    3.2 试验结果与分析
        3.2.1 CYP6CR1 基因序列全长及其分析
        3.2.2 系统发育分析
            3.2.2.1 华山松大小蠹CYP6CR
            3.2.2.2 华山松大小蠹ZnoDH
        3.2.3 亲水性/疏水性分析
        3.2.4 亚细胞定位与功能结构域分析
        3.2.5 二级结构和三级结构预测
第四章 华山松大小蠹CYP6CR1和ZnoDH基因在不同发育阶段、不同组织、以及不同处理下的表达分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 试验方法
            4.1.2.1 华山松大小蠹总RNA的提取
            4.1.2.2 华山松大小蠹cDNA反转录
            4.1.2.3 定量引物的设计与合成
            4.1.2.4 荧光定量检测
        4.1.3 定量数据处理与分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 不同发育阶段CYP6CR1、ZnoDH基因表达分析
        4.2.2 不同组织CYP6CR1、ZnoDH基因表达分析
        4.2.3 喂食处理对CYP6CR1、ZnoDH基因表达分析
        4.2.4 保幼激素处理对CYP6CR1、ZnoDH基因表达分析
第五章 讨论
第六章 结论
附录
参考文献
致谢
作者简介

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本文编号：2886510