BdCV1抗体制备、传染力测定及对轮纹病病菌基因表达影响的研究
发布时间：2021-04-13 23:02
梨轮纹病是由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea（B.dothidea）引起,主要危害蔷薇科树体枝干和果实,尤其在苹果和梨树果园中普遍发生的一类枝干病害,能引起树势衰弱,造成烂果,致使果品质量和产量受损,对果农造成严重的经济损失。真菌病毒介导弱毒菌株可作为生物防治真菌病害的一条主要途径,课题组初步证实侵染梨轮纹病病菌的真菌病毒BdCV1（Botryosphaeria dothidea Chrysovirus 1）引起轮纹菌致病力衰退,具有生防应用前景。本研究开展BdCV1抗体制备和检测效果分析,测定BdCV1在轮纹菌中的传染效率,分析其作为生防因子实践应用的可行性;证实BdCV1侵染下梨轮纹菌中mil RNA的存在和表达,分析预测mil RNA介导靶基因的表达模式,从分子水平上探究病毒对基因的影响。取得的具体研究结果如下:1.BdCV1抗体制备及检测效果分析采用蔗糖梯度超速离心提纯LW-C菌株中BdCV1病毒粒体,免疫大耳白兔,获得BdCV1多克隆抗体,测定抗体效价为1:51200;运用Western blot证实了BdCV1抗体具有较好的特异性。筛选和优化各项参数...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
–1菌株LW-C蔗糖梯度离心后各层蛋白的SDS-PAGE检测结果
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文183.1.2BdCV1病毒粒体的透射电镜观察将提纯的BdCV1病毒液负染铜网后，透射电镜进行观察，发现仅有一种直径大小一致的球状颗粒，里面包裹了核酸基因组，测量其大小，直径约为40nm（图2–2），结果显示获得了纯BdCV1病毒颗粒。图2–2病毒粒子透射电子显微镜图像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白浓度定量分析将25%–40%（w/v）蔗糖层中的蛋白进行提纯，得到浓度较高的病毒粒体，进行SDS-PAGE检测。各取12μL病毒蛋白提纯液以及等量的各浓度牛血清白蛋白进行电泳定量分析。结果显示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量较高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白浓度相当，估算约为0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白浓度则较低，约为0.1mg/mL，而CP蛋白的浓度则较高，达到1mg/mL左右（图2–3）。图2–3SDS-PAGE分析蛋白浓度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白样品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提纯所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白样品0.115M1234P125P79P77P82200nm
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文183.1.2BdCV1病毒粒体的透射电镜观察将提纯的BdCV1病毒液负染铜网后，透射电镜进行观察，发现仅有一种直径大小一致的球状颗粒，里面包裹了核酸基因组，测量其大小，直径约为40nm（图2–2），结果显示获得了纯BdCV1病毒颗粒。图2–2病毒粒子透射电子显微镜图像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白浓度定量分析将25%–40%（w/v）蔗糖层中的蛋白进行提纯，得到浓度较高的病毒粒体，进行SDS-PAGE检测。各取12μL病毒蛋白提纯液以及等量的各浓度牛血清白蛋白进行电泳定量分析。结果显示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量较高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白浓度相当，估算约为0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白浓度则较低，约为0.1mg/mL，而CP蛋白的浓度则较高，达到1mg/mL左右（图2–3）。图2–3SDS-PAGE分析蛋白浓度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白样品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提纯所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白样品0.115M1234P125P79P77P82200nm
【参考文献】：
期刊论文
[1]梨轮纹病的防治方法分析与探究[J]. 赵娜. 现代园艺. 2019(06)
[2]梨轮纹病发生规律及防治措施[J]. 周占兵. 河北果树. 2018(Z1)
[3]甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 许小洁,张继武,徐德坤,殷复伟,田延平,李向东. 山东农业科学. 2018(08)
[4]来源于湖北省梨轮纹病菌中真菌病毒多样性检测及其分析[J]. 罗慧,胡旺成,王国平,王利平. 植物病理学报. 2019(01)
[5]葡萄座腔菌科真菌的系统学和多样性探讨[J]. 李文英,李夏,解开治,邓旺秋,庄文颖. 生物多样性. 2017(08)
[6]低毒真菌病毒在植物病害生物防治中的研究及应用进展[J]. 刘忱,皮磊,舒灿伟,周而勋. 分子植物育种. 2018(02)
[7]来源于产黄青霉病毒科成员的分离物对梨轮纹病菌生长及其致病力的影响[J]. 王利华,罗慧,王国平,王利平. 果树学报. 2017(10)
[8]水稻纹枯病菌不致病菌株基因组重测序以及致病力相关基因分析[J]. 周梦琳,夏园,刘尧,何嘉瑜,张丹华,郑爱萍. 植物病理学报. 2017(06)
[9]梨轮纹病的发生规律与防治措施[J]. 朱永涛. 现代农村科技. 2017(03)
[10]真菌病毒的研究进展[J]. 唐利华,莫贱友,郭堂勋,李其利,黄穗萍. 中国农学通报. 2016(12)
博士论文
[1]湖北省水稻纹枯病菌病毒多样性及三个与寄主毒力相关新病毒的分子特性研究[D]. 吕锐玲.华中农业大学 2018
[2]葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程研究及一株低致病力菌株中病毒的鉴定[D]. 丁正.中国农业大学 2018
[3]梨轮纹病与干腐病的病原关系及轮纹病菌携带真菌病毒多样性研究[D]. 翟立峰.华中农业大学 2016
[4]柑橘衰退病毒的血清学特性分析及其诱导寄主差异表达基因的筛选[D]. 王彩霞.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA方法的建立[D]. 张立定.昆明理工大学 2019
[2]一种线性双链RNA病毒的鉴定及其分子生物学特性研究[D]. 荚恒霞.华中农业大学 2017
[3]稻瘟病菌dsRNA病毒分离鉴定及其对寄主的影响[D]. 李斌.湖南农业大学 2017
[4]LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定[D]. 冀文婕.大连理工大学 2016
[5]热处理对沙梨离体植株体内microRNAs和来源于ASGV的vsiRNAs的影响[D]. 刘娟.华中农业大学 2015
[6]Botryosphaeria dothidea病毒dsRNA的多样性研究[D]. 赵迎彤.山东农业大学 2014
[7]陕西省苹果轮纹病病原菌鉴定与多样性研究[D]. 孙鑫垚.西北农林科技大学 2010
[8]苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达[D]. 杨绍丽.华中农业大学 2008
本文编号：3136162
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
–1菌株LW-C蔗糖梯度离心后各层蛋白的SDS-PAGE检测结果
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文183.1.2BdCV1病毒粒体的透射电镜观察将提纯的BdCV1病毒液负染铜网后，透射电镜进行观察，发现仅有一种直径大小一致的球状颗粒，里面包裹了核酸基因组，测量其大小，直径约为40nm（图2–2），结果显示获得了纯BdCV1病毒颗粒。图2–2病毒粒子透射电子显微镜图像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白浓度定量分析将25%–40%（w/v）蔗糖层中的蛋白进行提纯，得到浓度较高的病毒粒体，进行SDS-PAGE检测。各取12μL病毒蛋白提纯液以及等量的各浓度牛血清白蛋白进行电泳定量分析。结果显示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量较高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白浓度相当，估算约为0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白浓度则较低，约为0.1mg/mL，而CP蛋白的浓度则较高，达到1mg/mL左右（图2–3）。图2–3SDS-PAGE分析蛋白浓度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白样品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提纯所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白样品0.115M1234P125P79P77P82200nm
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文183.1.2BdCV1病毒粒体的透射电镜观察将提纯的BdCV1病毒液负染铜网后，透射电镜进行观察，发现仅有一种直径大小一致的球状颗粒，里面包裹了核酸基因组，测量其大小，直径约为40nm（图2–2），结果显示获得了纯BdCV1病毒颗粒。图2–2病毒粒子透射电子显微镜图像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白浓度定量分析将25%–40%（w/v）蔗糖层中的蛋白进行提纯，得到浓度较高的病毒粒体，进行SDS-PAGE检测。各取12μL病毒蛋白提纯液以及等量的各浓度牛血清白蛋白进行电泳定量分析。结果显示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量较高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白浓度相当，估算约为0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白浓度则较低，约为0.1mg/mL，而CP蛋白的浓度则较高，达到1mg/mL左右（图2–3）。图2–3SDS-PAGE分析蛋白浓度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白样品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提纯所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白样品0.115M1234P125P79P77P82200nm
【参考文献】：
期刊论文
[1]梨轮纹病的防治方法分析与探究[J]. 赵娜. 现代园艺. 2019(06)
[2]梨轮纹病发生规律及防治措施[J]. 周占兵. 河北果树. 2018(Z1)
[3]甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 许小洁,张继武,徐德坤,殷复伟,田延平,李向东. 山东农业科学. 2018(08)
[4]来源于湖北省梨轮纹病菌中真菌病毒多样性检测及其分析[J]. 罗慧,胡旺成,王国平,王利平. 植物病理学报. 2019(01)
[5]葡萄座腔菌科真菌的系统学和多样性探讨[J]. 李文英,李夏,解开治,邓旺秋,庄文颖. 生物多样性. 2017(08)
[6]低毒真菌病毒在植物病害生物防治中的研究及应用进展[J]. 刘忱,皮磊,舒灿伟,周而勋. 分子植物育种. 2018(02)
[7]来源于产黄青霉病毒科成员的分离物对梨轮纹病菌生长及其致病力的影响[J]. 王利华,罗慧,王国平,王利平. 果树学报. 2017(10)
[8]水稻纹枯病菌不致病菌株基因组重测序以及致病力相关基因分析[J]. 周梦琳,夏园,刘尧,何嘉瑜,张丹华,郑爱萍. 植物病理学报. 2017(06)
[9]梨轮纹病的发生规律与防治措施[J]. 朱永涛. 现代农村科技. 2017(03)
[10]真菌病毒的研究进展[J]. 唐利华,莫贱友,郭堂勋,李其利,黄穗萍. 中国农学通报. 2016(12)
博士论文
[1]湖北省水稻纹枯病菌病毒多样性及三个与寄主毒力相关新病毒的分子特性研究[D]. 吕锐玲.华中农业大学 2018
[2]葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程研究及一株低致病力菌株中病毒的鉴定[D]. 丁正.中国农业大学 2018
[3]梨轮纹病与干腐病的病原关系及轮纹病菌携带真菌病毒多样性研究[D]. 翟立峰.华中农业大学 2016
[4]柑橘衰退病毒的血清学特性分析及其诱导寄主差异表达基因的筛选[D]. 王彩霞.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA方法的建立[D]. 张立定.昆明理工大学 2019
[2]一种线性双链RNA病毒的鉴定及其分子生物学特性研究[D]. 荚恒霞.华中农业大学 2017
[3]稻瘟病菌dsRNA病毒分离鉴定及其对寄主的影响[D]. 李斌.湖南农业大学 2017
[4]LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定[D]. 冀文婕.大连理工大学 2016
[5]热处理对沙梨离体植株体内microRNAs和来源于ASGV的vsiRNAs的影响[D]. 刘娟.华中农业大学 2015
[6]Botryosphaeria dothidea病毒dsRNA的多样性研究[D]. 赵迎彤.山东农业大学 2014
[7]陕西省苹果轮纹病病原菌鉴定与多样性研究[D]. 孙鑫垚.西北农林科技大学 2010
[8]苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达[D]. 杨绍丽.华中农业大学 2008
本文编号：3136162
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