番茄斑萎病毒病毒粒体的提取纯化及质谱分析

发布时间：2021-04-16 06:51

　　番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的代表种,该属病毒是唯一侵染植物的病毒。由于该病毒的寄主广泛,主要传毒介体西花蓟马分布范围广,且传毒持久,造成了全球范围内严重的经济损失,因此对于番茄斑萎病毒的研究是非常有迫切及有意义的。本研究通过在本氏烟及黄烟上摩擦接种TSWV,并收集发病系统叶,蔗糖梯度离心提取TSWV病毒颗粒,并通过SDS-PAGE验证获得了纯度较高的病毒颗粒,进一步进行质谱分析,分析结果为提取出的病毒颗粒中含有病毒蛋白如复制蛋白RdRp、糖蛋白Gn、Gc、非结构蛋白NSs、核衣壳蛋白N,另外还有植物蛋白hsp70、Sar1等。由于TSWV的外壳蛋白N可以与RdRp结合形成Ribonuc1eoprotein（RNP）,主要负责病毒的复制与转录,对于研究该病毒的形成具有重大作用。但是由于RdRp蛋白太大,难以完整表达,因此在本研究中通过分片段克隆插入载体,再通过原核表达不同片段的方式测试其与N的互作。将原核表达的RdRp不同片段与N互作,发现带有His标签的Rd... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１?ＴＳＷＶ蔗糖离心梯度??Ｆｉｇ．２－１?Ｓｕｃｒｏｓｅ?ｇｒａｄｉｅｎｔ?ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＳＷＶ??

温度为５６°Ｃ，选择两个阳性克隆摇菌提质粒。两个质粒均用Ｔ７Ｆ和Ｔ７Ｒ进行测序，??准备原核表达蛋白。１号克隆转化到Ｒｏｓｓｅｔａ中用ＩＰＴＧ诱导蛋白，ＳＤＡ－ＰＡＧＥ电泳后??可以看到一条约５８?ｋＤａ大小的目标蛋白条带（图３－２）。??Ｍ?ＢＳＡ?１?２?３??ｉ〇〇ｋｄ??７０ｋＤ??５５ｋＤ?ｍｍ?？?ｓ．??４０ＫＤ?故??３５ｋＤ??Ｈｒ．?＾?Ｐｗ??％??图?３－２?ｐＥＴ２８ａ－ＲｄＲｐ２３８０＿２８７８ａａ?原核表达纯化??Ｆｉｇ．３－２?ｐＥＴ２８ａ－ＲｄＲｐ２３８０?２８７８ａａ?ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??注：本图中Ｍ：蛋白Ｍａｋｅｒ；丨－３：不同浓度下的ｐＥＴ２８ａ－ＲｄＲｐ２３８０－２８７８ａａ表达纯化蛋白??３６??

山于ＲｄＲｐ蛋「丨太大，难以完整表达，因此将它分片段进行表达，测试与Ｎ的互作。??将原核农达的ＲｄＲｐ?片段ＵＮ吖作，发现带“Ｈｉｓ标签的ＲｄＲｐ２Ｍ８ａａ?ｊＶ段与ＧＳＴ－Ｎ??有微弱的互作现象，设置削性对照排除了?ＧＳＴ蛋白与ＲｄＲｐ互作的＂丨能（图３－４）。??ＧＳＴ－Ｎ?ＧＳＴ??／／?＾??６ｒｔｓ－ＲＤＲＰ＾Ｔ３－＾??ＧＳＴ?ｐｕｌｌ?ｄｏｗｎ??ＷＢ?Ｈｉｓ?ａｎｔｂｏｄｙ??ＧＳＴ－Ｎ?一??ＧＳＴ?ｐｕｌｌ?ｄｏｗｎ??ＷＢ?ＧＳＴｗｔｉｂｏｄｙ??ＧＳＴ?＾??图３－４?ＧＳＴ?ｐｕｌ卜ｄｏｗｎ验证Ｎ与ＲｄＲｐ的互作??Ｆｉｇ．３－４?ＧＳＴ?ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ?ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?Ｎ?ａｎｄ?ＲｄＲｐ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ??３７??

【参考文献】：
期刊论文
[1]从云南蝴蝶兰上检测到番茄斑萎病毒属病毒[J]. 程晓非,董家红,方琦,李婷婷,丁铭,张仲凯.  植物病理学报. 2008(01)
[2]生物质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J]. 王岚,刘骁勇,张华宁,高虹.  生物技术通讯. 2007(01)
[3]番茄斑萎病毒的检疫技术[J]. 洪霓.  植物检疫. 2006(06)
[4]番茄斑萎病毒侵染烟草的细胞病理[J]. 张仲凯,杨录明,方琦,彭潞波,汪继玲,普耀芳.  电子显微学报. 2004(04)
[5]四川晒烟上发现番茄斑萎病毒（TSWV）[J]. 姚革.  中国烟草. 1992(04)
[6]番茄斑萎病毒（TSWV）广州分离物生物学特性研究[J]. 许泽永,张宗义,陈金香.  植物病理学报. 1989(04)



本文编号：3140954