固氮和埃博霉素基因簇的异源表达
发布时间：2021-05-28 10:08
假单胞菌Pf-5（Pseudomonas protegens Pf-5）是一种重要的植物根际促生菌,能产生多种抑制植物病原菌的次级代谢产物,是生物防治制剂研究模式菌株,分布及其广泛,是植物根际环境中相对丰度很高的菌属。假单胞菌Pf-5 retS mutant突变株是实验室前期构建的工程菌株,通过突变假单胞菌Pf-5的retS基因从而提高了生物防治功能。斯氏假单胞菌DSM4166（Pseudomonas stutzeri DSM4166）全基因组序列已经公布,固氮基因簇nif注释清楚,能够进行生物固氮,但还没有生物防治的有关报道。同时具备固氮和生防作用的菌株很少,为了获得一株可广泛分布的既固氮又生防的多功能根际促生细菌,本研究通过在Pf-5和Pf-5 retS mutant菌株中异源表达DSM4166的固氮基因簇nif,构建了突变菌株Pf-5-nif和Pf-5 retS mutant-nif,成功实现了固氮基因簇的异源表达。本研究主要结果总结如下:1、将DSM4166的固氮基因簇nif通过接合转座的方式随机插入到Pf-5和Pf-5 retS mutant基因组中。2、通过乙炔还原法筛选到...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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离出的一类十六元环大环内酯类聚酮化合物［６７１，通常以甲基丙二酰－ＣｏＡ或丙二酰－??ＣｏＡ为原料，最终生成的埃博霉素类化合物主要有四种，分别是ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅＡ、Ｂ、??Ｃ和Ｄ?（图１－１）。埃博霉素和紫杉醇都是作用于胞内微管蛋白的天然药物，但是它??们的作用机制和结合位点存在差异。埃博霉素是和Ｐ微管蛋白Ｎ端的第２１７－２３１位??和第３１位氨基酸结合，通过促进微管蛋白聚合，抑制解聚，使纺锤体不能正常发挥??功能，肿瘤细胞核不能正常分裂，细胞有丝分裂停留在Ｇ２－Ｍ期，导致细胞死亡１６８】。??０?ＯＨ?０?ＴＸＴ??Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｔｉｉｌｏｎｅ?Ａ?Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎａ?Ｃ??Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?Ｂ?Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?０??图１－１埃博霉素结构示意图??Ｆｉｇ．．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ??埃博霉素基因簇序列全长约为５６?ｋｂ，包括７个转录方向一致的基因，９个模块??和４６个结构域＿。７个基因依次为ｅ／）〇．４，?ｅ／ｗｆｉ，?ｅ／ｗＣ，印〇Ａ印＜３五，印〇尸和??编码５个聚酮合酶（ｅｐｏＪ，?＃ｏＣ－?Ｆ），包括９个ＰＫＳ模块；１个非核糖体肽合成酶??（叩〇５），为１个ＮＰＫＳ个模块；及１个细胞色素Ｐ４５０氧化酶（印〇尺）。埃博霉素??生物合成途径共包括四个阶段：①聚酮链的引发和噻唑环的合成：印〇４基因负贵编??码加载模块ｍｏｄｕｌｅ?Ｌ，获得起始单元。下游紧邻的ＮＲＰＳ模块与ｍｏＪ共同催化??半胱氨酸和乙酰基的缩合
图２－ｌ菌落ＰＣＲ验证假单胞菌《／／固氮基因簇及相应的固氮酶活性。（Ａ）?？／／固氮基因簇示??Ｍ图。４个箭头处为４个保ｆ落ＰＣＲ处。（Ｂ）?ＰＣＲ产物琼胎糖凝胶屯泳阐。ｂａｎｄｌ－４：?４个ＰＣ产物，目的条带都在１?ｋｂ左右。Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ５０００，条带大小依次为５０００，?３０００，??２０００，?１５００，?１０００，７５０，?５００，２５０，?１００；?１－５：做完接合转移的?ｐｆ－５?单克隆菌落；Ｐｆ－５：??ｐｆ－５野生型，阴性对照；６－１０：做完接合转移的Ｐｆ－５ｍＳ?ｍｕｔａｎｔ单克隆菌落；ｒｅＡＳ??ｍｕｔａｎｔ：?Ｐｆ－５?ｒｅｔＳ?ｍｕｔａｎｔ工程菌株，阴性对照；Ｐ：?固Ｍ基因族直接克隆质粒，阳性对??照；ＤＳＭ４１６６：?ＤＳＭ４１６６野生型，阳性对照。（Ｃ）固氮酶活性测定结果。ＤＳＭ４１６６：??ＤＳＭ４１６６野生型，阳性对照。Ｍ／１－９为Ｂ中的丨－９，?Ｐｆ－５：?ｐｆ－５野生型，阴性对照。每组至测三次取平均值，条形代表平均值的标准误差。根据方差分析，＊＊ｐ＜０．０丨和＊＊＊ｐ＜０．００１，??Ｄｕｎｎｅｔｔ作为术后测试。??Ｆｉｇ．．?２－１?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＰＣＲ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｉｎ?Ｐ．?ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ（Ａ）Ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｍａｐ．?Ｆｏｕｒ?ａｒｒｏｗｓ?ｗｅｒｅ?ｌｏｃａｔｅｄ?ａｔ?ｆｏｕｒ?ｃｏｌｏｎｙ?ＰＣＲ?ｓｉｔｅｓ．（Ｂ）Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅ２
【参考文献】：
期刊论文
[1]自生固氮菌的固氮能力及其对春小麦生长发育的影响[J]. 卢秉林,王文丽,李娟,郭天文. 中国生态农业学报. 2009(05)
[2]抗癌新药埃博霉素的研究与开发(二)[J]. 阎家麒,高荣,谢建平,周彬. 精细与专用化学品. 2008(06)
[3]根际微生态系统中豆科植物-根瘤菌共生固氮及其在可持续农业发展中的作用[J]. 刘永秀,张福锁,毛达如. 中国农业科技导报. 1999(04)
本文编号：3208064
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
鍥撅紤锛嶏紤鍩冨崥闇夌礌缁撴瀯绀烘剰鍥绢棐顥忥鸡锝夛絿锛庯紟顥ワ紤锛嶏紤顥ワ汲锝旓綊锝曪絻锝旓綍锝掞絽顥ワ綇锝嗩棩锝咃綈锝忥綌锝堬綁锝岋綇锝庯絽顥掝棌
离出的一类十六元环大环内酯类聚酮化合物［６７１，通常以甲基丙二酰－ＣｏＡ或丙二酰－??ＣｏＡ为原料，最终生成的埃博霉素类化合物主要有四种，分别是ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅＡ、Ｂ、??Ｃ和Ｄ?（图１－１）。埃博霉素和紫杉醇都是作用于胞内微管蛋白的天然药物，但是它??们的作用机制和结合位点存在差异。埃博霉素是和Ｐ微管蛋白Ｎ端的第２１７－２３１位??和第３１位氨基酸结合，通过促进微管蛋白聚合，抑制解聚，使纺锤体不能正常发挥??功能，肿瘤细胞核不能正常分裂，细胞有丝分裂停留在Ｇ２－Ｍ期，导致细胞死亡１６８】。??０?ＯＨ?０?ＴＸＴ??Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｔｉｉｌｏｎｅ?Ａ?Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎａ?Ｃ??Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?Ｂ?Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?０??图１－１埃博霉素结构示意图??Ｆｉｇ．．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ??埃博霉素基因簇序列全长约为５６?ｋｂ，包括７个转录方向一致的基因，９个模块??和４６个结构域＿。７个基因依次为ｅ／）〇．４，?ｅ／ｗｆｉ，?ｅ／ｗＣ，印〇Ａ印＜３五，印〇尸和??编码５个聚酮合酶（ｅｐｏＪ，?＃ｏＣ－?Ｆ），包括９个ＰＫＳ模块；１个非核糖体肽合成酶??（叩〇５），为１个ＮＰＫＳ个模块；及１个细胞色素Ｐ４５０氧化酶（印〇尺）。埃博霉素??生物合成途径共包括四个阶段：①聚酮链的引发和噻唑环的合成：印〇４基因负贵编??码加载模块ｍｏｄｕｌｅ?Ｌ，获得起始单元。下游紧邻的ＮＲＰＳ模块与ｍｏＪ共同催化??半胱氨酸和乙酰基的缩合
图２－ｌ菌落ＰＣＲ验证假单胞菌《／／固氮基因簇及相应的固氮酶活性。（Ａ）?？／／固氮基因簇示??Ｍ图。４个箭头处为４个保ｆ落ＰＣＲ处。（Ｂ）?ＰＣＲ产物琼胎糖凝胶屯泳阐。ｂａｎｄｌ－４：?４个ＰＣ产物，目的条带都在１?ｋｂ左右。Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ５０００，条带大小依次为５０００，?３０００，??２０００，?１５００，?１０００，７５０，?５００，２５０，?１００；?１－５：做完接合转移的?ｐｆ－５?单克隆菌落；Ｐｆ－５：??ｐｆ－５野生型，阴性对照；６－１０：做完接合转移的Ｐｆ－５ｍＳ?ｍｕｔａｎｔ单克隆菌落；ｒｅＡＳ??ｍｕｔａｎｔ：?Ｐｆ－５?ｒｅｔＳ?ｍｕｔａｎｔ工程菌株，阴性对照；Ｐ：?固Ｍ基因族直接克隆质粒，阳性对??照；ＤＳＭ４１６６：?ＤＳＭ４１６６野生型，阳性对照。（Ｃ）固氮酶活性测定结果。ＤＳＭ４１６６：??ＤＳＭ４１６６野生型，阳性对照。Ｍ／１－９为Ｂ中的丨－９，?Ｐｆ－５：?ｐｆ－５野生型，阴性对照。每组至测三次取平均值，条形代表平均值的标准误差。根据方差分析，＊＊ｐ＜０．０丨和＊＊＊ｐ＜０．００１，??Ｄｕｎｎｅｔｔ作为术后测试。??Ｆｉｇ．．?２－１?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＰＣＲ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｉｎ?Ｐ．?ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ（Ａ）Ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｍａｐ．?Ｆｏｕｒ?ａｒｒｏｗｓ?ｗｅｒｅ?ｌｏｃａｔｅｄ?ａｔ?ｆｏｕｒ?ｃｏｌｏｎｙ?ＰＣＲ?ｓｉｔｅｓ．（Ｂ）Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅ２
【参考文献】：
期刊论文
[1]自生固氮菌的固氮能力及其对春小麦生长发育的影响[J]. 卢秉林,王文丽,李娟,郭天文. 中国生态农业学报. 2009(05)
[2]抗癌新药埃博霉素的研究与开发(二)[J]. 阎家麒,高荣,谢建平,周彬. 精细与专用化学品. 2008(06)
[3]根际微生态系统中豆科植物-根瘤菌共生固氮及其在可持续农业发展中的作用[J]. 刘永秀,张福锁,毛达如. 中国农业科技导报. 1999(04)
本文编号：3208064
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