拮抗根癌土壤杆菌的桃内生细菌的筛选鉴定
发布时间：2021-07-10 06:00
【目的】从对根癌病具有获得抗性（SAR）的桃单株"西北13-1"的枝条内分离鉴定内生细菌,分析其种群组成并从中筛选拮抗根癌土壤杆菌的高效生防菌,为桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌资源。【方法】首先,将根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）接种到"西北13-1"的桃树枝条上,并以无菌水接种作为对照;然后,分别于接种前、接种后10 d和接种后60 d采集接种处理和对照处理的"西北13-1"枝条。表面消毒桃树枝条样品后采用涂布平板法分离内生细菌;并结合16S r DNA序列鉴定,比对初步鉴定菌株,分析内生细菌的数量及组成差异。采用平板拮抗法、温室防病效果测定筛选拮抗根癌土壤杆菌的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定,明确其分类地位。为揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用机制,通过电击转化将含有GFP基因的p BBR1MCS-2质粒导入拮抗菌株中,然后进行GFP标记菌株对根癌土壤杆菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用灌根法提前接种标记菌株菌悬液,第2天接种根癌土壤杆菌菌悬液,应用激光扫描共聚焦显微镜和平板稀释法研究标记菌株在番茄根部的定殖情况。【结...
【文章来源】：中国农业科学. 2017,50(20)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
不同处理枝条中内Fig.2Differencesinthecompositionofendophytic
谱饔?Table1SuppressioneffectofantagonisticbacteriaongallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowers菌株Strain病情指数Diseaseindex防治效果Controlefficacy(%)10DM4-19.17±1.44b86.08±2.19a10DI2-26.67±5.77b89.87±8.77a10DM4-1-gfp13.33±2.89b79.74±4.39a10DI2-2-gfp5.83±5.20b91.14±7.90aCK65.83±3.82a—数据后不同小写字母表示差异显著（P≤0.05）Differentlowercasesfollowingthedataindicatedsignificantdifference(P≤0.05)A:CK;B:10DM4-1;C:10DI2-2;D:10DM4-1-gfp;E:10DI2-2-gfp图3拮抗菌对根癌土壤杆菌侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用Fig.3SuppressioneffectofantagonistsoncrowngallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowerseedlings2.2.2拮抗菌的菌落形态和生理生化特性菌株10DM4-1在NA培养基上的单菌落圆形扁平，呈黄色，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色阴性，接触酶反应阳性，不水解明胶等。根据菌体形态特征、生化特性及Biolog测定结果（表2），初步判定10DM4-1为Pantoeadeleyi[28-30]。菌株10DI2-2在NA培养基上的单菌落圆形中凸，呈淡黄色，表面光滑黏稠。革兰氏染色阴性，能水解七叶灵等。根据菌体形态特征、生化特性及Biolog测定结果（表3），初步判定10DI2-2为Enterobactercowanii[31-32]。2.2.316SrDNA序列测定及其系统发育分析菌株10DM4-1和10DI2-2的16SrDNA序列已提交至GenBank，登录号分别为KY451836和KY451837。16SrDNA序列比对结果显示，10DM4-1与P.deleyi（EF688011）相似性达98.94%，且与其在系统发育树同一分支（图4-A），结合形态学特征和生理生化特性，将10DM4-1鉴定为P.deleyi。10DI2-2的16SrDNA序列与E.cowanii（AJ508303）序列相似性达99.56%，且与其?
3926中国农业科学50卷A：10DM4-1-gfp的荧光显微镜观察Fluorescencedetectionofstrain10DM4-1-gfpunderfluorescencemicroscope；B：10DI2-2-gfp的荧光显微镜观察Fluorescencedetectionofstrain10DI2-2-gfpunderfluorescencemicroscope图5转化子的荧光检测Fig.5Identificationoftransformantsbyfluorescenceunderfluorescencemicroscope后开始衰亡。荧光镜检结果表明连续转接10次后，菌落仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，标记菌株质粒的稳定性接近100%。10DM4-1、10DM4-1-gfp、10DI2-2和10DI2-2-gfp对根癌土壤杆菌形成的抑菌圈直径（mm）分别为12.29±1.02a、13.41±0.52a、12.47±0.78a和13.44±0.94a，平板抑菌活性检测及温室防病效果测定（表1）的结果表明标记菌株10DM4-1-gfp、10DI2-2-gfp分别与原始菌株10DM4-1、10DI2-2对根癌土壤杆菌的抑菌活性无明显差异。结果证明外源质粒的存在及GFP的表达未对菌株10DM4-1和10DI2-2的生理代谢、生防功能产生明显的不利影响。2.4标记菌株在番茄根际的定殖定殖试验结果表明，10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根当天的初始菌量接近108CFU/g，3d后种群数量迅速下降至106CFU/g，随后下降速度稍缓，10d后种群数量约为104CFU/g，30d后标记菌株仍然能被检测到且数量级趋于稳定，同样约为104CFU/g。用蔡司激光共聚焦显微镜观察到，灌根当天10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp的绿色菌体大量定殖在番茄根围，形成一层绿色的保护膜，处理3d后绿色菌体的数量迅速下降，标记菌株大量进入细胞间隙，10d及30d之后标记菌株在番茄根部的定殖动态变化不大，在30d后根部细胞间隙能明显观测到绿色菌群（图6）。对照组在接种3d后没有发现任何荧光，表明该番茄根组织没有背景荧光。3讨论植物内生细菌指能
【参考文献】：
期刊论文
[1]2株桃树根际细菌Alcaligenes faecalis对根癌病的抑制作用[J]. 高之蕾,李茜,郭荣君,李世东,李世访,王红清. 果树学报. 2015(02)
[2]植物内生细菌及其生防作用研究进展[J]. 何玲敏,叶建仁. 南京林业大学学报(自然科学版). 2014(06)
[3]枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力[J]. 刘邮洲,梁雪杰,乔俊卿,张荣胜,陈志谊. 植物保护学报. 2014(04)
[4]植物内生菌分离方法的研究现状[J]. 王志勇,刘秀娟. 贵州农业科学. 2014(01)
[5]黄瓜初花期与结瓜期叶片可培养内生细菌多样性研究[J]. 孙占斌,袁行方,王音娴,张辉,张文会,冯永君. 微生物学通报. 2012(06)
[6]根癌农杆菌电击转化条件的研究[J]. 张云峰,邵磊. 淮阴师范学院学报(自然科学版). 2009(03)
[7]植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展[J]. 林玲,乔勇升,顾本康,周益军,董汉松. 江苏农业学报. 2008(06)
[8]植物内生细菌在防治植物病害中的应用研究[J]. 闫孟红,蔡正求,韩继刚,孙磊,宋未. 生物技术通报. 2004(03)
[9]内生细菌作为生防因子的研究进展[J]. 孔庆科,丁爱云. 山东农业大学学报(自然科学版). 2001(02)
[10]增产菌的应用与研究[J]. 陈延熙,陈璧,潘贞德,王淑芝. 生物防治通报. 1985(02)
本文编号：3275334
【文章来源】：中国农业科学. 2017,50(20)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
不同处理枝条中内Fig.2Differencesinthecompositionofendophytic
谱饔?Table1SuppressioneffectofantagonisticbacteriaongallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowers菌株Strain病情指数Diseaseindex防治效果Controlefficacy(%)10DM4-19.17±1.44b86.08±2.19a10DI2-26.67±5.77b89.87±8.77a10DM4-1-gfp13.33±2.89b79.74±4.39a10DI2-2-gfp5.83±5.20b91.14±7.90aCK65.83±3.82a—数据后不同小写字母表示差异显著（P≤0.05）Differentlowercasesfollowingthedataindicatedsignificantdifference(P≤0.05)A:CK;B:10DM4-1;C:10DI2-2;D:10DM4-1-gfp;E:10DI2-2-gfp图3拮抗菌对根癌土壤杆菌侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用Fig.3SuppressioneffectofantagonistsoncrowngallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowerseedlings2.2.2拮抗菌的菌落形态和生理生化特性菌株10DM4-1在NA培养基上的单菌落圆形扁平，呈黄色，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色阴性，接触酶反应阳性，不水解明胶等。根据菌体形态特征、生化特性及Biolog测定结果（表2），初步判定10DM4-1为Pantoeadeleyi[28-30]。菌株10DI2-2在NA培养基上的单菌落圆形中凸，呈淡黄色，表面光滑黏稠。革兰氏染色阴性，能水解七叶灵等。根据菌体形态特征、生化特性及Biolog测定结果（表3），初步判定10DI2-2为Enterobactercowanii[31-32]。2.2.316SrDNA序列测定及其系统发育分析菌株10DM4-1和10DI2-2的16SrDNA序列已提交至GenBank，登录号分别为KY451836和KY451837。16SrDNA序列比对结果显示，10DM4-1与P.deleyi（EF688011）相似性达98.94%，且与其在系统发育树同一分支（图4-A），结合形态学特征和生理生化特性，将10DM4-1鉴定为P.deleyi。10DI2-2的16SrDNA序列与E.cowanii（AJ508303）序列相似性达99.56%，且与其?
3926中国农业科学50卷A：10DM4-1-gfp的荧光显微镜观察Fluorescencedetectionofstrain10DM4-1-gfpunderfluorescencemicroscope；B：10DI2-2-gfp的荧光显微镜观察Fluorescencedetectionofstrain10DI2-2-gfpunderfluorescencemicroscope图5转化子的荧光检测Fig.5Identificationoftransformantsbyfluorescenceunderfluorescencemicroscope后开始衰亡。荧光镜检结果表明连续转接10次后，菌落仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，标记菌株质粒的稳定性接近100%。10DM4-1、10DM4-1-gfp、10DI2-2和10DI2-2-gfp对根癌土壤杆菌形成的抑菌圈直径（mm）分别为12.29±1.02a、13.41±0.52a、12.47±0.78a和13.44±0.94a，平板抑菌活性检测及温室防病效果测定（表1）的结果表明标记菌株10DM4-1-gfp、10DI2-2-gfp分别与原始菌株10DM4-1、10DI2-2对根癌土壤杆菌的抑菌活性无明显差异。结果证明外源质粒的存在及GFP的表达未对菌株10DM4-1和10DI2-2的生理代谢、生防功能产生明显的不利影响。2.4标记菌株在番茄根际的定殖定殖试验结果表明，10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根当天的初始菌量接近108CFU/g，3d后种群数量迅速下降至106CFU/g，随后下降速度稍缓，10d后种群数量约为104CFU/g，30d后标记菌株仍然能被检测到且数量级趋于稳定，同样约为104CFU/g。用蔡司激光共聚焦显微镜观察到，灌根当天10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp的绿色菌体大量定殖在番茄根围，形成一层绿色的保护膜，处理3d后绿色菌体的数量迅速下降，标记菌株大量进入细胞间隙，10d及30d之后标记菌株在番茄根部的定殖动态变化不大，在30d后根部细胞间隙能明显观测到绿色菌群（图6）。对照组在接种3d后没有发现任何荧光，表明该番茄根组织没有背景荧光。3讨论植物内生细菌指能
【参考文献】：
期刊论文
[1]2株桃树根际细菌Alcaligenes faecalis对根癌病的抑制作用[J]. 高之蕾,李茜,郭荣君,李世东,李世访,王红清. 果树学报. 2015(02)
[2]植物内生细菌及其生防作用研究进展[J]. 何玲敏,叶建仁. 南京林业大学学报(自然科学版). 2014(06)
[3]枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力[J]. 刘邮洲,梁雪杰,乔俊卿,张荣胜,陈志谊. 植物保护学报. 2014(04)
[4]植物内生菌分离方法的研究现状[J]. 王志勇,刘秀娟. 贵州农业科学. 2014(01)
[5]黄瓜初花期与结瓜期叶片可培养内生细菌多样性研究[J]. 孙占斌,袁行方,王音娴,张辉,张文会,冯永君. 微生物学通报. 2012(06)
[6]根癌农杆菌电击转化条件的研究[J]. 张云峰,邵磊. 淮阴师范学院学报(自然科学版). 2009(03)
[7]植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展[J]. 林玲,乔勇升,顾本康,周益军,董汉松. 江苏农业学报. 2008(06)
[8]植物内生细菌在防治植物病害中的应用研究[J]. 闫孟红,蔡正求,韩继刚,孙磊,宋未. 生物技术通报. 2004(03)
[9]内生细菌作为生防因子的研究进展[J]. 孔庆科,丁爱云. 山东农业大学学报(自然科学版). 2001(02)
[10]增产菌的应用与研究[J]. 陈延熙,陈璧,潘贞德,王淑芝. 生物防治通报. 1985(02)
本文编号：3275334
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