甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1原核表达、纯化及酶学性质分析

发布时间：2021-08-15 10:03

　　【目的】谷氧还蛋白（glutaredoxin, Grx）是生物体内依赖硫醇的抗氧化酶,在生物氧化胁迫和细胞凋亡等许多重要的生命活动中发挥作用。本研究旨在测定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧还蛋白家族成员SeGrx1的基因序列以及酶催化反应特性,为揭示其在昆虫体内功能奠定基础。【方法】以前期获得的甜菜夜蛾转录组数据为基础,采用RACE-PCR技术克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全长序列。将甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列连接至pET-16b原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG诱导融合蛋白表达后用镍柱和Superdex75/200分子筛纯化;采用荧光酶标仪测定纯化的SeGrx1的活性及酶促反应动力学参数。【结果】甜菜夜蛾SeGrx1基因（GenBank登录号:MK318813） cDNA全长738 bp,其中5′非编码区长40 bp,3′非编码区长347 bp,开放阅读框（ORF）全长351 bp,编码116个氨基酸,预测蛋白的相对分子量为12.57 kD,活性位点为CPYC,为双巯基谷氧还蛋白。SeGrx1中心由4个平行和反... 

【文章来源】：昆虫学报. 2020,63(08)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

4种昆虫Grx1蛋白氨基酸序列比对

通过对甜菜夜蛾转录组数据分析获得的甜菜夜蛾Grx1基因片段进行克隆,获得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。结果显示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全长为738 bp(GenBank登录号: MK318813),其中5′非编码区长40 bp,3′非编码区长347 bp,开放阅读框(ORF)全长为351 bp(图1),编码116个氨基酸。预测蛋白分子质量为12.57 kD,等电点(pI)为8.45,不含信号肽序列。NCBI Blast数据显示获得的甜菜夜蛾谷氧还蛋白氨基酸序列隶属于人类GRX human class 1 and 2 (h_1_2)-like亚家族,与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Grx1和Grx2氨基酸序列一致性分别为33.06%和31.47%,但是酿酒酵母Grx2在N端含有信号肽序列。因此,我们确认本研究中获得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶为Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1与鳞翅目昆虫家蚕Bombyx mori, 棉铃虫Helicoverpa armigera和斜纹夜蛾Spodoptera litura的同源氨基酸序列进行多重比对,与家蚕BmGrx1同源性最高,序列一致性为81.03%,与斜纹夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低,为67.80%。它们都具有5个α螺旋4个β折叠等保守序列,含有经典的KXXCPYC催化位点特征残基,CPYC为双巯基活性位点,且只有这一个谷氧还蛋白结构域,为双巯基谷氧还蛋白(图2)。

应用MEGA7.0中的邻接法,对甜菜夜蛾SeGrx1和其他11种昆虫的Grx1基因构建系统发育树(图3)。如图所示,脐橙螟蛾Amyelois transitella和丛林斜眼褐蝶Bicyclus anynana Grxs聚为一个分支,同时又和甜菜夜蛾SeGrx1聚为同一分支,表明这3个物种在进化上距离较近。利用DNAMAN翻译的相应氨基酸序列,输入到STRING在线工具,预测蛋白相互作用网络。因昆虫谷氧还蛋白研究本身较少,在选择分类时,我们选择人类基因组进行,输入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列,bit score最高的是人类谷氧还蛋白2(GLRX2),与2.1节中三维结构预测选择人类谷氧还蛋白2作为模板相一致。因此,以人类谷氧还蛋白2作为模板进行相互作用网络预测。预测结果表明与目标蛋白人类谷氧还蛋白2存在已知、预测或其他相互作用关系的蛋白有硫氧还蛋白(TXN),谷氧还蛋白酶3和5(GLR3和GLR5),谷胱甘肽还原酶(GSR),磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4),硫氧化还蛋白2(TXN2),过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),以及过氧化物还原酶3和6(PRDX3和PRDX6),这些蛋白的主要功能具有相似性,通过调节细胞内氧化还原状态而参与多种细胞生理过程,表明SeGrx2在保护昆虫组织免受氧化胁迫损伤中可能发挥重要作用。


本文编号：3344341