利用枯草芽胞杆菌表达系统进行节节麦抗菌基因的克隆

发布时间：2021-09-03 01:46

　　抗菌肽作为先天免疫系统中的一个重要组成,在自然界许多生物中广泛存在。近年来,由于病原菌耐药性的出现,使得抗菌肽得到越来越多的关注,但是在筛选新抗菌肽过程中仍存在一定难度。枯草芽胞杆菌具有高效分泌表达蛋白的能力,本研究使用本实验室建立的高效筛选抗菌肽的方法,利用枯草芽胞杆菌表达系统来筛选新抗菌肽。本研究利用枯草芽胞杆菌表达系统构建节节麦c DNA文库,在文库质量评价后进行文库筛选,筛选依据是抗菌蛋白对宿主细胞造成损伤从而出现自溶现象,同时在扫描电镜下可以观察到候选蛋白菌株出现皱缩和穿孔等现象。本研究初步筛选得到37个抗菌蛋白。此外,利用硫酸铵法提取候选抗菌蛋白,观察对细菌的抑制作用并再次筛选出对多种细菌有抑制作用的6个候选抗菌肽。本研究选择2个具有广谱抗性的候选抗菌肽继续研究并利用二级结构预测工具对筛选出来的6个候选抗菌肽进行生物信息预测。本研究使用的2个抗菌肽同时具有α-螺旋和β-折叠,因此推测同时含有α-螺旋和β-折叠的肽抗菌活性更明显。对2个候选抗菌肽进行热稳定性实验,结果表明,即使在100℃高温处理下,2个抗菌肽仍具有抑菌活性。溶血性实验结果表明,在最高浓度1000μg/m L处... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

抗菌肽的二级结构示意图(Petersetal2010)

华中农业大学2020届硕士研究生学位论文4图1-2抗菌肽对细胞膜的影响示意图(Ageitosetal2017)Fig.1-2Effectofantimicrobialpeptidesoncellmembrane(Ageitosetal2017)除了直接靶向病原体的细胞膜和细胞质的这些抗菌肽之外，生物体内还存在另一种抗菌肽，称为宿主防御肽(hostdefensepeptides，HDPs)，这一类抗菌肽作为先天免疫系统中进化保守的分子。宿主防御肽的目标是广泛的病原体，在宿主细胞的先天免疫和适应性免疫反应中发挥出多功能作用(Mansouretal2014)。先天免疫是由多种细胞类型介导的，尤其是粘膜和皮肤表面的上皮细胞，它们是抵御病原体进入的屏障。吞噬细胞存在于组织中，或从血液中移动到感染部位。先天免疫调节包括：（1）降低微生物特征分子产生的炎症因子水平；（2）调节趋化因子、活性氧和活性氮的表达；（3）刺激血管生成；（4）促进伤口愈合；（5）白细胞激活；（6）巨噬细胞和白细胞分化等(Hilchieetal2013)。

利用枯草芽胞杆菌表达系统进行节节麦抗菌基因的克隆9菌IA751基因组整合了ComK基因得到菌株SCK6，通过木糖诱导的启动子诱导ComK的表达，最终制备了可通过外源DNA和多聚体质粒有效转化的枯草芽胞杆菌SCK6超级感受态细胞(ZhangandZhang2011)。本研究使用的菌株就是枯草芽胞杆菌SCK6。枯草芽胞杆菌表达系统可以将蛋白质从细胞质分泌到细胞外，其分泌系统主要依赖于信号肽(SPs)的分泌途径。枯草芽胞杆菌至少存在四种分泌途径：Sec分泌途径、Tat分泌途径、ABC转运子途径和假菌丝蛋白输出途径(Tjalsmaetal2004)。假菌丝蛋白输出途径与枯草芽胞杆菌感受态形成有关(Chungetal1998)。大部分蛋白是通过Sec、Tac和ABC途径分泌的(图1-3)。虽然枯草芽白杆菌具有分泌蛋白的能力，但是蛋白的表达和分泌量却不高，因此，研究分泌途径的机制，有助于解决蛋白分泌量不高的问题(Wangetal2016)。图1-3枯草杆菌分泌途径的示意图(LingLinetal2007)Fig.1-3SchematicofsecretionpathwayinB.subtilis(LingLinetal2007)虽然蛋白的分泌途径不同，但是通过细胞质膜转运的蛋白质都具有N-末端信号肽，其中包含三个不同的区域：一个带正电荷的N-结构域，一个疏水的H-结构域，以及一个带有信号肽酶切割位点的C-结构域(PohlandHarwood2010)。当信号肽把蛋白送到正确位置时，信号肽就会被特异性信号肽酶(SPPases)降解(Songetal2015)。不同的信号肽被不同的信号肽酶识别，因此也就有不同的信号识别位点(图1-4)。


本文编号：3380155