基于CRISPR/Cas9技术的水稻WRKY28突变体创制及其基因的抗病功能探索

发布时间：2021-09-09 20:14

　　水稻是世界上超过一半的人口的主要粮食作物,而由黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzaae,Xoo）引起的水稻白叶枯病（Bacterial blight,BB）是影响其产量的主要病害之一。WRKY转录因子是与植物抗病密切相关的转录因子,对其研究不仅有助于我们了解植物抗病防御反应机制,并且能为传统育种和基因工程育种提供基因资源和相关理论指导。本实验室前期研究中,发现一个抗病相关基因OsWRKY28。此外,近年来,CRISPR/Cas9系统因其定点突变效率高被成功运用于多种物种的基因编辑中。本研究围绕测试改造后的CRISPR/Cas9系统效率和分析OsWRKY28基因的功能展开,研究的内容主要如下:1.CRISPR/Cas9载体改造及应用其编辑水稻D3基因以测试效率以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因编辑载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴（Oryza sativa L.spp.Japonicaa cv.Nipponbare）D3 基因的 3 个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Ca... 

【文章来源】：浙江师范大学浙江省

【文章页数】：112 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．３水稻历基因结构及ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９靶位点示意图??

校遥?茫幔螅乖靥逵呕?坝τ闷浔嗉??荆冢谆?颍崳?方式Ｍｕｔａｎｔｌ为缺失八个碱基（ＣＡＧＴＴＧＣＧ）；总突变率为２９．２３％，共产生１１种??突变。具体突变方式如图２．４所示。??Ａ?ＤＤＲＣＫ１１／３１）??ＣＫｉＡＣｉＴＡＣｉＡＣＴｎＣ＇ＧＣＣＣＡＴＣＫｉＣＧＧ?ＷＴ??ＧＧＡＣｉＴＡ（ｉＡＣ（ｎＣ（ｊＣＣＣ—（ＫｉＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ?１??ＣＫｉＡＧＴＡＣｉＡＣＧＲＸｉＣＣＣ－ＴＣＫｉＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｉ２??（ｉＣｉＡＣｎＡ（ｉＡＣ（ｉＴＣ（ｉＣＣＣＡＴＴ（ｉＧＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ？??ＣｉＧＡＧＴＡＣｉＡＣＣｉＴＣＣｉＣＣＣＡＧＴＣｉＧＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ４??ＧＧＡＧ１ＡＧＡＣＧ１ＣＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣＧＧ?Ｍｕｉａｎｌ５??Ｂ?ＤＤＲＣ２（６／２４）??ＣＣＣＴＵＣＡ（ｉＴ（；ＴＴ（；ＣＡＡＡＴ（ｉＧＣＡＣ?ＷＴ??ＣＣＣＴＧＣＡＧ１ＣＪ?ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣ?Ｍｕｌａｎｔ?１??ＣＣＣ１ＧＣ?ＣＴ１?ＴＯＣＡＡＡｒＧＧＣＡＣ?Ｍｉｎａｉｎ２??ＣＣＣＴＧＣ?ＡＧＴ—ＴＧＣ?ＡＡＡＴＧＧＣ?ＡＣ?Ｍｕｉａｎｉ？??ＣＣＣＴＧＣＡＧ—ＴＴ（＇ｊＣＡＡＡＴ（｝（ｉＣＡＣ?Ｍｍａｍ４??ＣＣＣＴＧＣＡ?ＴＧＣ?ＡＡＡＴＧＧＣ?ＡＣ?Ｍｕｔａｎｔ？??Ｃ?ＤＤＲＣ３（２／１０）??ＧＣＧＧＧＡＣ＇ＡＩＧＣ＇ＡＧＴＴＧＣＧＧＧＡＧＧ?ＷＴ??（＇．ＣＣＫＫＪＡＣＡＴＧ?ＧＣ５ＡＧＧ?Ｍｕｉａｎｌ?１??图２．４?ＴＱ代转基因植株具体突变类型??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｔｈｅ?ｍｕｔａｔｉｏｎ?ｔｙｐｅ?ｏｆ?Ｔ〇?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??图中绿色序列表示ＰＡＭ位点

?：?ｔ?ＨＩ??Ａｍａａ／Ｖ＼ａ／＼Ａ?ｍ／Ｗ＼??图２．５?Ｔ，代转基因植株的测序结果??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?Ｔｊ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??图Ａ为株系ａ：ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔｌ）纯合突变植株ａｌ、ａ２的测序结果；图Ｂ为株系??ｂ：ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔ３）纯合突变植株ｂｌ的测序结果；图Ｃ为株系ｃ：ＤＤＲＣ２（Ｍｕｔａｎｔ２）纯合突变??植株ｃｌ的测序结果；图Ｄ为株系ｄ：ＤＤＲＣ３（Ｍｕｔａｎｔｌ）纯合突变植株ｄｌ、ｄ２的测序结果。??Ａ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔｓ?ａｌａｎｄ?ａ２?ｏｆ?ｔｈｅ?ＤＤＲＣ１?（Ｍｕｔａｎｔ?１）；?Ｂ，??ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔ?ｂｌ?ｏｆ?ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔ３）；?Ｃ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔ?ｃｌ?ｏｆ?ＤＤＲＣ２（Ｍｕｔａｎｔ２）；?Ｄ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔｓ?ｄｌａｎｄ?ｄ２?ｏｆ?ＤＤＲＣ３（Ｍｕｔａｎｔｌ）．??２．３．３转基因水稻突变体植株表型鉴定??如表２．４与图２．７所示，３周龄乃代纯合突变植株中，ａｌ、ａ２对应的的靶位??点为ＤＤＲＣ１，突变方式为缺失两个碱基（ＡＴ），与野生型日本晴相比，株高及分??蘖数都没有明显变化；ｂｌ对应的靶位点为ＤＤＲＣ１

【参考文献】：
期刊论文
[1]枸杞WRKY3基因克隆及组织表达分析[J]. 徐惠娟,郑蕊,陈任,王彦才,王丽娟.  西北植物学报. 2016(09)
[2]水稻白叶枯病再流行原因分析与防控对策研究[J]. 沈颖,王华弟,李仲惺,叶建人,赵敏.  中国农学通报. 2016(24)
[3]普通小麦转录因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析[J]. 刘自成,苗丽丽,王景一,杨德龙,毛新国,景蕊莲.  中国农业科学. 2016(12)
[4]水稻白叶枯病发生危害损失动态与模型预测的探讨[J]. 王华弟,沈颖,赵敏,叶建人,黄贤夫,李仲惺.  中国植保导刊. 2016(04)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]Research Progress on Functional Analysis of Rice WRKY Genes[J]. SONG Yu1,2,AI Chong-rui1,JING Shao-juan1,2,YU Di-qiu1 (1Key Laboratory of Tropical Forest Ecology,Xishuangbanna Tropical Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650223,China;2Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Bejing 100049,China).  Rice Science. 2010(01)
[7]中国杂交水稻白叶枯病抗性的遗传改良[J]. 章琦.  中国水稻科学. 2009(02)
[8]稻瘟菌诱导的水稻WRKY基因OsWRKY52的分离和鉴定（英文）[J]. 王海华,谢科,吴坤陆,郭泽建.  生物化学与生物物理进展. 2005(10)
[9]OsWRKY03, a rice transcriptional activator that functions in defense signaling pathway upstream of OsNPR1[J]. Xiao Qiang LIU1,2, Xian Quan BAI1,2, Qian QIAN3, Xiu Jie WANG1, Ming Sheng CHEN1, Cheng Cai CHU1,* 1National Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Yuquan Road, Beijing 100039, China 3China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310006, China.  Cell Research. 2005(08)
[10]植物转录因子与基因调控[J]. 李洁.  生物学通报. 2004(03)



本文编号：3392716