小麦条锈菌柠檬酸合酶基因PsCS1的克隆与功能分析
发布时间：2021-09-22 18:07
TCA循环是需氧生物细胞内广泛存在的代谢途径,是机体利用糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。柠檬酸合酶,作为TCA循环的限速酶,参与细胞内多种生理过程,如:线粒体能量代谢、种子萌发和抗逆等,在医学、农学上具有广泛的应用价值。小麦条锈菌是一种活体营养专性寄生真菌,必须依赖侵染结构—吸器从寄主中获取营养。解析条锈菌的营养代谢过程,对于小麦条锈病的防控具有重要意义。大量的研究已经表明,柠檬酸合酶在病菌的生长发育及致病过程中起重要作用,然而,目前关于柠檬酸合酶在小麦条锈菌侵染过程中作用的研究尚未见报道。基于此,本研究对小麦条锈菌柠檬酸合酶基因进行克隆表达及功能鉴定,具体结果如下:通过生物信息学分析及PCR技术,成功克隆获得一条具有完整ORF的小麦条锈菌柠檬酸合酶基因,命名为PsCS1,其全长为1407bp,编码491个氨基酸,具有柠檬酸合酶的保守结构域;利用qRT-PCR对PsCS1在条锈菌侵染过程中的表达特征进行分析,PsCS1在条锈菌侵染早期上调表达;通过原核表达证明其具有柠檬酸合酶的功能;酶学活性分析显示:该酶在低温时酶活力较高,最适pH为8,K+能显著提高柠檬...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
影响三羧酸循环的关键步骤(Simcocketal.2011)Fig1TCAcycleactivity-catalyticefficiency
第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3结果分析2.3.1总RNA分析提取小麦与条锈菌混合的叶片总RNA，RNA溶液的A260/A280比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1，经核酸浓度检测仪检测该值介于1.8到2.0之间；1.2%琼脂糖凝胶跑胶检测表明提取的RNA比较好，符合后续实验要求，可用于下一步实验分析（图2-1）。图2-11.2%琼脂糖凝胶电泳检测小麦叶片总RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以总RNA反转录的cDNA为模板，对候选靶标基因序列设计引物后对其进行扩增，用1％琼脂糖凝胶跑胶检测PCR产物。结果如图：在约1000-2000bp中间有一条特别亮的DNA扩增条带，大小与生物信息学分析的序列相一致，并将该基因命名为PsCS1。图2-2PCR扩增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段经回收纯化、连T-vector、转化大肠杆菌JM109感受态cell，挑选经菌落PCR鉴定正确的单一菌斑，送杨凌奥科进行测序。测序结果表明，该基因由1407个碱基组成，包含完整的开放阅读框，共编码491个氨基酸残基。
第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3结果分析2.3.1总RNA分析提取小麦与条锈菌混合的叶片总RNA，RNA溶液的A260/A280比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1，经核酸浓度检测仪检测该值介于1.8到2.0之间；1.2%琼脂糖凝胶跑胶检测表明提取的RNA比较好，符合后续实验要求，可用于下一步实验分析（图2-1）。图2-11.2%琼脂糖凝胶电泳检测小麦叶片总RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以总RNA反转录的cDNA为模板，对候选靶标基因序列设计引物后对其进行扩增，用1％琼脂糖凝胶跑胶检测PCR产物。结果如图：在约1000-2000bp中间有一条特别亮的DNA扩增条带，大小与生物信息学分析的序列相一致，并将该基因命名为PsCS1。图2-2PCR扩增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段经回收纯化、连T-vector、转化大肠杆菌JM109感受态cell，挑选经菌落PCR鉴定正确的单一菌斑，送杨凌奥科进行测序。测序结果表明，该基因由1407个碱基组成，包含完整的开放阅读框，共编码491个氨基酸残基。
【参考文献】：
期刊论文
[1]柠檬酸合酶的分子生物学研究进展[J]. 葛亚东,潘蔚,汪劼,朱国萍. 生物学杂志. 2010(03)
[2]烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建[J]. 胡清泉,王奇峰,李昆志,陈丽梅,玉永雄. 草业学报. 2009(04)
[3]香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析[J]. 迟光红,周雪丽,李美英,徐碧玉,金志强. 热带农业科学. 2009(08)
本文编号：3404166
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
影响三羧酸循环的关键步骤(Simcocketal.2011)Fig1TCAcycleactivity-catalyticefficiency
第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3结果分析2.3.1总RNA分析提取小麦与条锈菌混合的叶片总RNA，RNA溶液的A260/A280比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1，经核酸浓度检测仪检测该值介于1.8到2.0之间；1.2%琼脂糖凝胶跑胶检测表明提取的RNA比较好，符合后续实验要求，可用于下一步实验分析（图2-1）。图2-11.2%琼脂糖凝胶电泳检测小麦叶片总RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以总RNA反转录的cDNA为模板，对候选靶标基因序列设计引物后对其进行扩增，用1％琼脂糖凝胶跑胶检测PCR产物。结果如图：在约1000-2000bp中间有一条特别亮的DNA扩增条带，大小与生物信息学分析的序列相一致，并将该基因命名为PsCS1。图2-2PCR扩增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段经回收纯化、连T-vector、转化大肠杆菌JM109感受态cell，挑选经菌落PCR鉴定正确的单一菌斑，送杨凌奥科进行测序。测序结果表明，该基因由1407个碱基组成，包含完整的开放阅读框，共编码491个氨基酸残基。
第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3结果分析2.3.1总RNA分析提取小麦与条锈菌混合的叶片总RNA，RNA溶液的A260/A280比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1，经核酸浓度检测仪检测该值介于1.8到2.0之间；1.2%琼脂糖凝胶跑胶检测表明提取的RNA比较好，符合后续实验要求，可用于下一步实验分析（图2-1）。图2-11.2%琼脂糖凝胶电泳检测小麦叶片总RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以总RNA反转录的cDNA为模板，对候选靶标基因序列设计引物后对其进行扩增，用1％琼脂糖凝胶跑胶检测PCR产物。结果如图：在约1000-2000bp中间有一条特别亮的DNA扩增条带，大小与生物信息学分析的序列相一致，并将该基因命名为PsCS1。图2-2PCR扩增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段经回收纯化、连T-vector、转化大肠杆菌JM109感受态cell，挑选经菌落PCR鉴定正确的单一菌斑，送杨凌奥科进行测序。测序结果表明，该基因由1407个碱基组成，包含完整的开放阅读框，共编码491个氨基酸残基。
【参考文献】：
期刊论文
[1]柠檬酸合酶的分子生物学研究进展[J]. 葛亚东,潘蔚,汪劼,朱国萍. 生物学杂志. 2010(03)
[2]烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建[J]. 胡清泉,王奇峰,李昆志,陈丽梅,玉永雄. 草业学报. 2009(04)
[3]香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析[J]. 迟光红,周雪丽,李美英,徐碧玉,金志强. 热带农业科学. 2009(08)
本文编号：3404166
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