褐飞虱乙酰胆碱酯酶启动子的克隆及表观遗传分析

发布时间：2021-09-24 00:14

　　褐飞虱Nilaparvata lugens是水稻的重要害虫之一.本研究旨在扩增褐飞虱乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）基因的启动子,并从表观遗传学的角度探讨DNA甲基化与褐飞虱生物型进化间的关系.采用染色体步移（genome walking）方法扩增AChE启动子,根据所得启动子序列设计甲基化特异性PCR（MS-PCR）引物和重亚硫酸盐测序法BSP引物,分析褐飞虱生物型Ⅰ和生物型Ⅱ中AChE启动子的甲基化程度,然后利用荧光定量PCR技术检测AChE的表达水平差异.结果表明,扩增得到褐飞虱AChE上游侧翼DNA序列长度为1 919 bp,启动子元件分析显示,AChE启动子区域中有若干与MYB、WRKY、ARE等抗性相关转录因子的结合位点（元件）,表明该启动子可能与逆境胁迫相关.基于甲基化水平的限制酶酶切位点分析发现,AChE启动子区域含有多个^5mCG甲基化位点,表明该区域DNA甲基化主要发生在胞嘧啶的C-5位.MS-PCR分析表明,生物型Ⅰ褐飞虱AChE启动子区域的甲基化程度高于生物型Ⅱ; BSP结果显示生物型Ⅰ启动子区域总体平均甲基... 

【文章来源】：湖北大学学报(自然科学版). 2020,42(04)

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

TAIL PCR扩增结果

以亚硫酸氢盐处理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因组DNA为模板进行MS-PCR扩增，结果如图2所示．泳道1和2分别为生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E启动子区未发生甲基化位点扩增条带;3和4分别为生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E启动子区发生甲基化-位点扩增条带．从图中1和2看出生物型Ⅱ能扩增出明显的非甲基化条带而生物型Ⅰ中扩增出非甲基化条带较浅，从3和4看出生物型Ⅰ能扩增出明显的甲基化条带而生物型Ⅱ中扩增出甲基化条带不明显，说明在生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E启动子中甲基化程度存在差异，且生物型Ⅰ的甲基化程度明显高于生物型Ⅱ．两种生物型两对引物均扩增出条带，表明该Cp G位点只部分发生甲基化．扩增得到的启动子序列通过网站(http://www.takara-bio.co.jp/enzyme/enzyme＿search.php)进行启动子区域受甲基化影响的限制酶酶切位点分析，结果显示褐飞虱ACh E启动子区域主要甲基化酶切位点为Cp G methylase(5 mCG)，表明褐飞虱ACh E启动子区域DNA甲基化主要发生在胞嘧啶的C-5位．

以亚硫酸氢盐处理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因组DNA为模板进行BS-PCR扩增，1～4均为Ⅰ型褐飞虱BSP扩增产物;5～8均为Ⅱ型褐飞虱BSP扩增产物．结果如图3所示:目的片段经胶回收纯化，连接p Clone007-T载体，菌落PCR验证后每种生物型均挑取10个阳性克隆子送至武汉擎科生物公司测序．根据测序结果利用在线网站(http://quma.cdb.riken.jp/)分析获得两种生物型ACh E启动子区Cp G岛的甲基化情况，并绘制黑白点图(图4和图5).


本文编号：3406706