本氏烟NbRDR1m天然突变体原型NbRDR1在病毒防御中的功能研究

发布时间：2021-10-12 20:56

　　植物体内依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RDRs）可介导RNA沉默信号的放大,在植物病毒防御反应中起着至关重要的作用。与烟草属中其他种类的相比,本氏烟（Nicotianabenthamiana）对病毒侵染表现出超敏感,通常会表现出更为严重的病毒症状。有研究表明本氏烟NbRDR1m（NicotianabenthamianaRNA dependent RNA polymerase 1 mutant）编码区的开放阅读框架内有一段72个碱基的插入片段,该插入片段造成开放阅读框架的提前终止而不能得到全长且有功能的NbRDR1蛋白可能是造成其对病毒侵染超敏感的主要原因。但该猜测并未得到证实。为了确证这一猜测,我们首先通过融合PCR技术去除NbRDR1m中72个插入碱基,将NbRDR1m恢复至NbRDR1的原型。然后将该原型NbRDR1构建双元载体并转化至野生型本氏烟中创制过表达NbRDR1的转基因株系。通过抗生素筛选和基因组PCR,鉴定出转基因株系并采用半定量RT-PCR分析各转基因株系NbRDR1的表达情况。随机挑选2个表达量较高和一个表达量... 

【文章来源】：浙江师范大学浙江省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 文献综述
    1 基因沉默
    2 RDRs
        2.1 RNA病毒
        2.2 植物体内的RDRs
        2.3 病毒与宿主植物侵染与反侵染之间的较量
    3 RDRs的研究进展
        3.1 拟南芥中的RDRs
        3.2 烟草中RDRs的研究进展
        3.3 马铃薯RDR1的研究进展
    4 本研究的目的和主要研究内容
第二章 实验材料与方法
    1 实验材料
        1.1 植物材料
        1.2 载体和菌株
        1.3 供试病毒
        1.4 实验仪器和试剂
    2 实验方法
        2.1 本氏烟总RNA的提取与检测
        2.2 融合PCR技术构建无72个碱基插入的NbRDR1基因
            2.2.1 cDNA的产生
            2.2.2 目的基因的获得
            2.2.3 目的基因的纯化
        2.3 pCambia 2300S载体的构建
            2.3.1 引物设计
            2.3.2 将NbRDR1基因克隆至pCambia 2300S载体
        2.4 质粒基因组DNA的提取
        2.5 转基因本氏烟的转化
            2.5.1 MS (Murashige and Skoog)培养基的配置
            2.5.2 无菌本氏烟的培养
            2.5.3 含目的载体菌液的获得
            2.5.4 预培养
            2.5.5 侵染暗培养
            2.5.6 洗涤及筛选
            2.5.7 继代培养
            2.5.8 生根培养
            2.5.9 炼苗培养
        2.6 转基因本氏烟株系的鉴定
            2.6.1 鉴定引物的设计
            2.6.2 转基因本氏烟再生植株基因组DNA的提取
            2.6.3 转基因再生株系的PCR鉴定
            2.6.4 转基因再生株系的RTPCR鉴定
        2.7 转基因本氏烟烟草再生株系病毒侵染鉴定
            2.7.1 T1代转基因植株的获得
            2.7.2 T1代转基因植株对病毒的抗性鉴定
第三章 结果与分析
    1 pCambia 2300S-NbRDR1载体的构建
        1.1 融合PCR技术构建无72个碱基插入的NbRDR1基因
        1.2 将目的基因克隆至pCambia 2300S-NbRDR1载体
    2 过表达NbRDR1转基因本氏烟株系的创制
    3 转基因再生株系的分子鉴定
        3.1 转基因再生株系的基因组PCR鉴定
        3.2 转基因本氏烟再生株系的RTPCR分析
    4 转基因本氏烟株系病毒侵染的抗病性鉴定
        4.1 过表达NbRDR1可增强本氏烟对TMV-GFP的抗性
        4.2 过表达NbRDR1可增强本氏烟对非烟草属病毒TuMV-GFP及PVX-GFP的抗性
第四章 讨论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Viral suppression of RNA silencing[J]. JIANG Lin, WEI ChunHong & LI Yi * State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China.  Science China（Life Sciences）. 2012(02)
[2]转录后基因沉默——植物抵御外来病毒入侵的一种机制[J]. 冯德江,刘翔,朱祯.  遗传学报. 2003(06)



本文编号：3433283