水稻细胞质类受体激酶OsRLCK185介导几丁质激活MAPK抗病信号的机理研究

发布时间：2021-10-15 08:50

　　水稻是我国最重要的粮食作物,而稻瘟病是目前对水稻生产威胁最大的真菌病害。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）细胞壁中的几丁质（Chitin）作为一类保守的病原菌相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern,PAMP）,可以被植物细胞膜上的模式识别受体（PAMP recognition receptor,PRR）Os CERK1间接识别,通过磷酸化的方式激活下游一系列生化生理反应,从而增强植物对病原菌的抗病性。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）是一组能够在PAMP识别后被激活的蛋白激酶,其基本组成是一种保守的三级激酶模式,包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase,MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase,MKK）和MAPK,这三种激酶通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子,是真核生物信号传递网络中的重要途径之一。然而,植物如何将细胞膜产生的PAMP识别信号传递到下游MAPK,其机制仍然存在空白。细胞质类受体激酶（Rec... 

【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：150 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 PTI模式分子的识别
        1.1.1 细菌PAMP的识别
        1.1.2 真菌PAMP的识别
        1.1.3 卵菌PAMP的识别
        1.1.4 寄主细胞状态变化(损伤相关的分子模式,DAMP)的识别
        1.1.5 特征信号分子的跨界识别
    1.2 经典PRR模式识别系统——FLS2和EFR
    1.3 PRR参与调控共生互作
    1.4 PRR调控植物对环境因子变化的响应
    1.5 PTI激活下游的信号转导事件以及细胞、生理反应
        1.5.1 胞内钙离子浓度上升
        1.5.2 胞外碱化和细胞膜去极化反应
        1.5.3 活性氧迸发
        1.5.4 细胞质类受体激酶激活
        1.5.5 MAPK激活
        1.5.6 小G蛋白激活
    1.6 本课题的研究目的和意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种
        2.1.3 载体
        2.1.4 主要试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 酵母双杂交实验
        2.2.2 植物RNA提取、反转录和定量PCR
        2.2.3 重组蛋白诱导表达和纯化
        2.2.4 Pulldown实验
        2.2.5 蛋白质免疫印迹(Westernblot)
        2.2.6 蛋白磷酸化检测
        2.2.7 植物组织总蛋白提取
        2.2.8 Co-IP实验
        2.2.9 MAPK活性检测
        2.2.10 基因诱导表达处理
        2.2.11 稻瘟病侵染实验
        2.2.12 本氏烟农杆菌转化和病毒介导的基因沉默
第三章 结果
    3.1 筛选与OsRLCK185互作的水稻MEKK1家族成员
    3.2 OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作验证
        3.2.1 利用酵母双杂交实验验证OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作
        3.2.2 用体外Pulldown实验验证OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作
        3.2.3 用体内Co-IP实验验证OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作
    3.3 OsMAPKKKε的C端结构域负责与OsRLCK185互作
    3.4 OsRLCK185磷酸化OsMAPKKKε
        3.4.1 OsRLCK185体外磷酸化OsMAPKKKε全长蛋白
        3.4.2 OsRLCK185体外磷酸化OsMAPKKKε的C端结构域(aa769-1357)
        3.4.3 OsRLCK185体外磷酸化OsMAPKKKε的丝氨酸和苏氨酸
    3.5 OsMAPKKKε能够与OsMKK4、OsMKK5互作
        3.5.1 用酵母双杂交技术验证OsMAPKKKε与OsMKK4、OsMKK5互作
        3.5.2 用Co-IP技术验证OsMAPKKKε与OsMKK4、OsMKK5互作
    3.6 OsMAPKKKε能够磷酸化OsMKK
        3.6.1 体外磷酸化实验证明OsMAPKKKε能够磷酸化OsMKK
        3.6.2 用体内磷酸化实验证明OsMAPKKKε能够磷酸化OsMKK
    3.7 OsCERK1促进OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作
    3.8 OsCERK1体外促进OsRLCK185对OsMAPKKKε的磷酸化
    3.9 烟草细胞中模拟磷酸化形式的OsRLCK185-3D与OsMAPKKKε共表达可以激活MAPK磷酸化
    3.10 OsMAPKKKε沉默植株的MAPK响应几丁质能力减弱
        3.10.1 OsMAPKKKε沉默水稻的MAPK响应几丁质能力减弱
        3.10.2 NbMAPKKKε沉默本氏烟的MAPK响应几丁质能力减弱
    3.11 OsMAPKKKε沉默植株对稻瘟抗病能力减弱
    3.12 全长OsMAPKKKε能够在几丁质处理下激活MAPK级联反应
    3.13 OsMAPKKKε激酶结构域组成型激活MAPK级联反应
        3.13.1 在本氏烟系统里OsMAPKKKε激酶结构域能够组成型激活MAPK级联反应
        3.13.2 在水稻体内OsMAPKKKε激酶结构域能够组成型激活MAPK级联反应
    3.14 OsMAPKKKε激酶结构域在本氏烟叶片中激活细胞坏死并且C端结构域能够调控该表型
    3.15 OsMAPKKKε激酶结构域组成型激活防卫相关基因表达
    3.16 OsMAPKKKε激酶结构域组成性激活水稻对稻瘟抗病性
    3.17 OsMAPKKKε在根茎叶中均有表达,其亚细胞定位有可能在细胞膜
    3.18 OsRACK1A作为支架蛋白与MAPK级联通路互作
    3.19 OsRLCK185与OsRac1在酵母双杂交系统中互作
    3.20 在酵母双杂交系统中OsRLCK185与激活形式的OsRac1互作
    3.21 OsRLCK185能够在体外磷酸化OsRac
    3.22 在酵母双杂交系统中OsMAPKKKε与失活形式的OsRac1互作
    3.23 在酵母三杂交系统中激活形式的OsRac1能够抑制OsRLCK185与OsMAPKKKε的互作
第四章 讨论
    4.1 OsRLCK185直接将OsCERK1识别的几丁质信号传递至OsMAPKKKε-OsMKK4/5-OsMPK3/6组成的MAPK级联通路模块
    4.2 RLCK 和 MAPKKK 很可能具有冗余性
    4.3 Os MAPKKKε 如何在几丁质识别抗病信号中发挥功能
    4.4 小G蛋白OsRac1如何参与OsRLCK185-MAPK级联通路
    4.5 RLCK 家族蛋白可能广谱介导植物 RLK 对配体信号识别与MAPK级联通路之间的联系
第五章 全文的总结、创新点与展望
    5.1 全文总结
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
附录
    1 经过密码子优化后的OsMAPKKKε序列
    2 引物列表
作者简历及在学期间所取得的科研成果
致谢



本文编号：3437771