三七种子带菌检测与根腐病快速分子检测方法的建立及防治
发布时间：2021-11-27 18:46
三七是中国特有的中药材,药用价值高,市场需求量大,但受连作障碍的影响,产业发展严重受阻。土壤消毒作为一种高效、广谱的病虫害防治方法,对土壤中的真菌、细菌、线虫、害虫等均有杀灭作用,在遏制番茄、黄瓜、草莓等土传病害方面效果显著,但在中药材上应用较少。本文以腐皮镰刀菌引起的三七根腐病为研究对象,建立了腐皮镰刀菌型三七根腐病的实时荧光定量PCR法,探讨了三种熏蒸剂对腐皮镰刀菌的抑制效果和作用机制,并用高通量测序的方法研究了氯化苦在三七种植地应用后对土壤微生物群落结构和多样性的影响。主要研究结果如下:1.调查了三七种子的带菌情况,种子表面和内部携带的病原菌种类差异较大。三七种子表面携带的真菌主要为镰刀菌,种子内部携带的真菌主要为番茄织球壳菌萎蔫病。2.明确了腐皮镰刀菌是三七根腐病的重要病原物,能导致三七根部腐烂,植株死亡。系统发育树分析发现三七上的腐皮镰刀菌属于两个不同的专化型,其中一个是腐皮镰刀菌根生专化型。3.基于腐皮镰刀菌TEF-1α基因设计了一对新的引物,建立了能特异性检测土壤中腐皮镰刀菌的qPCR法,该方法重复性良好,灵敏度高,最低可检测0.5 fgDNA和1个分生孢子/g土壤。4....
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图３－１?ＰＤＡ培养基上腐皮镰刀菌的菌落形态?
３．４．２柯赫氏法则验证结果??接种７天后，所有接种孢子悬浮液的种苗都有了发病症状，接种的部位长出浓密的白色菌丝??体，菌丝体周围变成黒褐色，剖开种苗内部观察到内部腐烂成豆腐渣状，呈黄绿色，详见图３－３。??柯赫氏法则验证结果表明，该菌是三七的致病菌，能导致根腐病的发病症状。??３．４．３分子生物学鉴定结果??以?ＩＴＳ１?和?ＩＴＳ４?为引物，对获得的菌株（０６０８，?０６０９，０６１０，０６１１，０６１２，０６１８，０６２２）的??进行常规ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物测序，发现这７个菌株的ＩＴＳ序列相似度高达９９％，并且与??腐皮镰刀菌的序列高度一致。进一步对０６１８菌株的ＩＴＳ序列进行了?ＰＣＲ扩增和克隆测序，将测??序结果进行Ｂｌａｓｔ比对，结果发现该菌株的ＩＴＳ序列与腐皮镰刀菌根生专化型Ｆｗｓａｎ＇ｗｗ?ｆ．?ｓｐ．??ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ?（ＡＢ５１３８５１．１）序列相似度达?１００％。??将上述７个菌株的ＩＴＳ序列与腐皮谦刀菌根生专化型、Ｆｗｓａｒ／願?ＴＯ／ａｒａ＇?ｆ．?ｓｐ．?腐??皮银刀菌甘薯专化型?Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉｆ?ｓｐ．?ｂａｔａｔａｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ?ｆ．?ｓｐ．?ｇｆｙｃｉｎｅｓ、Ｆｕｓｃｉｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ??ｆ．ｓｐ．ｅｗａｒ／／／的ＩＴＳ序列进行比对，以尖孢镰刀菌作为外围菌群，构建系统发育树（图３－４）。从??系统发育树看，获得的７个菌株划分到两类专化型，其中０６１１、０６１２、０６１８、０６２２等４个菌株??划分到腐皮镰刀菌根生专化型分支中
＂＂＂＇??图３－４基于ＩＴＳ序列构建的系统发育树??（系统发育树基于最大似然法，自展重复率为１０００步）??３．４．４实时荧光定量ＰＣＲ分析结果??３．４．４．１标准曲线的建立??实时荧光定量ＰＣＲ的标准曲线是利用ＤＮＡ浓度的对数值对应相应的Ｃｑ值构建的。将０６１８??基因组ＤＮＡ的对数值作为横坐标，以其相对应的Ｃｑ值作为纵坐标作图，即可获得一条基于Ｃｑ??值和ＤＮＡ浓度的回归曲线，两者呈现线性关系（图３－５），其线性回归方程为Ｙ＝－３．３６］Ｘ＋４１．９７１??其中Ｙ表示Ｃｑ值，Ｘ表示ＤＮＡ浓度的对数值，其相对应的相关系数（Ｒ２）为０．９９２，扩増效率??Ｅ值为９８．４％。根据实时荧光定量ＰＣＲ获得的Ｃｑ值，通过回归方程可以计算样品中目标ＤＮＡ??的浓度，再根据公式计算可以得到相应的拷贝数。??２６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]三七功用与化学成分[J]. 周晨,刘辉. 实用中医内科杂志. 2018(08)
[2]三七药理作用研究进展[J]. 庞丹清,陈勇,刘玟君,阙祖亮,李金洲,陈子隽,魏江存. 大众科技. 2018(09)
[3]黄花蒿叶甲醇粗提物对尖孢镰刀菌的抑制作用[J]. 马玉楠,陈传娇,马晓惠,程永现,董鲜,徐福荣. 中国现代中药. 2018(06)
[4]三七连作根际微生物多样性研究[J]. 付丽娜,汪娅婷,王星,姬广海,魏兰芳. 云南农业大学学报(自然科学). 2018(02)
[5]三七种子带菌检测及致病菌鉴定研究[J]. 赵芝,罗丽芬,郑建芬,何霞红,刘西莉,朱书生,杨敏. 云南农业大学学报(自然科学). 2017(06)
[6]三七植物化学成分及药理作用研究进展[J]. 杨娟,袁一怔,尉广飞,张连娟,徐江,董林林. 世界科学技术-中医药现代化. 2017(10)
[7]三七总皂苷药理作用的研究进展[J]. 李青融,王子妤. 湖南中医杂志. 2017(09)
[8]黄花蒿叶水提物对三七根际尖孢镰刀菌生长的抑制作用[J]. 赵雅萌,马玉楠,陈传娇,程永现,董鲜,徐福荣. 天然产物研究与开发. 2018(03)
[9]不同施肥处理调节土壤pH值对三七发病率及其生长的影响[J]. 吴凤云,崔秀明,杨野,官会林. 云南大学学报(自然科学版). 2017(05)
[10]三七的化学成分和药理作用研究[J]. 谭辉. 中国中医药现代远程教育. 2017(17)
博士论文
[1]三七根际土壤微生物的群落特征[D]. 苗翠苹.云南大学 2015
[2]人参化感作用及其忌连作机制研究[D]. 陈长宝.吉林农业大学 2006
[3]人参、西洋参和三七化学成分的研究[D]. 张崇喜.吉林农业大学 2004
硕士论文
[1]三七根腐病病原真菌的初步研究[D]. 乔新国.云南大学 2015
本文编号：3522848
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图３－１?ＰＤＡ培养基上腐皮镰刀菌的菌落形态?
３．４．２柯赫氏法则验证结果??接种７天后，所有接种孢子悬浮液的种苗都有了发病症状，接种的部位长出浓密的白色菌丝??体，菌丝体周围变成黒褐色，剖开种苗内部观察到内部腐烂成豆腐渣状，呈黄绿色，详见图３－３。??柯赫氏法则验证结果表明，该菌是三七的致病菌，能导致根腐病的发病症状。??３．４．３分子生物学鉴定结果??以?ＩＴＳ１?和?ＩＴＳ４?为引物，对获得的菌株（０６０８，?０６０９，０６１０，０６１１，０６１２，０６１８，０６２２）的??进行常规ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物测序，发现这７个菌株的ＩＴＳ序列相似度高达９９％，并且与??腐皮镰刀菌的序列高度一致。进一步对０６１８菌株的ＩＴＳ序列进行了?ＰＣＲ扩增和克隆测序，将测??序结果进行Ｂｌａｓｔ比对，结果发现该菌株的ＩＴＳ序列与腐皮镰刀菌根生专化型Ｆｗｓａｎ＇ｗｗ?ｆ．?ｓｐ．??ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ?（ＡＢ５１３８５１．１）序列相似度达?１００％。??将上述７个菌株的ＩＴＳ序列与腐皮谦刀菌根生专化型、Ｆｗｓａｒ／願?ＴＯ／ａｒａ＇?ｆ．?ｓｐ．?腐??皮银刀菌甘薯专化型?Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉｆ?ｓｐ．?ｂａｔａｔａｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ?ｆ．?ｓｐ．?ｇｆｙｃｉｎｅｓ、Ｆｕｓｃｉｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ??ｆ．ｓｐ．ｅｗａｒ／／／的ＩＴＳ序列进行比对，以尖孢镰刀菌作为外围菌群，构建系统发育树（图３－４）。从??系统发育树看，获得的７个菌株划分到两类专化型，其中０６１１、０６１２、０６１８、０６２２等４个菌株??划分到腐皮镰刀菌根生专化型分支中
＂＂＂＇??图３－４基于ＩＴＳ序列构建的系统发育树??（系统发育树基于最大似然法，自展重复率为１０００步）??３．４．４实时荧光定量ＰＣＲ分析结果??３．４．４．１标准曲线的建立??实时荧光定量ＰＣＲ的标准曲线是利用ＤＮＡ浓度的对数值对应相应的Ｃｑ值构建的。将０６１８??基因组ＤＮＡ的对数值作为横坐标，以其相对应的Ｃｑ值作为纵坐标作图，即可获得一条基于Ｃｑ??值和ＤＮＡ浓度的回归曲线，两者呈现线性关系（图３－５），其线性回归方程为Ｙ＝－３．３６］Ｘ＋４１．９７１??其中Ｙ表示Ｃｑ值，Ｘ表示ＤＮＡ浓度的对数值，其相对应的相关系数（Ｒ２）为０．９９２，扩増效率??Ｅ值为９８．４％。根据实时荧光定量ＰＣＲ获得的Ｃｑ值，通过回归方程可以计算样品中目标ＤＮＡ??的浓度，再根据公式计算可以得到相应的拷贝数。??２６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]三七功用与化学成分[J]. 周晨,刘辉. 实用中医内科杂志. 2018(08)
[2]三七药理作用研究进展[J]. 庞丹清,陈勇,刘玟君,阙祖亮,李金洲,陈子隽,魏江存. 大众科技. 2018(09)
[3]黄花蒿叶甲醇粗提物对尖孢镰刀菌的抑制作用[J]. 马玉楠,陈传娇,马晓惠,程永现,董鲜,徐福荣. 中国现代中药. 2018(06)
[4]三七连作根际微生物多样性研究[J]. 付丽娜,汪娅婷,王星,姬广海,魏兰芳. 云南农业大学学报(自然科学). 2018(02)
[5]三七种子带菌检测及致病菌鉴定研究[J]. 赵芝,罗丽芬,郑建芬,何霞红,刘西莉,朱书生,杨敏. 云南农业大学学报(自然科学). 2017(06)
[6]三七植物化学成分及药理作用研究进展[J]. 杨娟,袁一怔,尉广飞,张连娟,徐江,董林林. 世界科学技术-中医药现代化. 2017(10)
[7]三七总皂苷药理作用的研究进展[J]. 李青融,王子妤. 湖南中医杂志. 2017(09)
[8]黄花蒿叶水提物对三七根际尖孢镰刀菌生长的抑制作用[J]. 赵雅萌,马玉楠,陈传娇,程永现,董鲜,徐福荣. 天然产物研究与开发. 2018(03)
[9]不同施肥处理调节土壤pH值对三七发病率及其生长的影响[J]. 吴凤云,崔秀明,杨野,官会林. 云南大学学报(自然科学版). 2017(05)
[10]三七的化学成分和药理作用研究[J]. 谭辉. 中国中医药现代远程教育. 2017(17)
博士论文
[1]三七根际土壤微生物的群落特征[D]. 苗翠苹.云南大学 2015
[2]人参化感作用及其忌连作机制研究[D]. 陈长宝.吉林农业大学 2006
[3]人参、西洋参和三七化学成分的研究[D]. 张崇喜.吉林农业大学 2004
硕士论文
[1]三七根腐病病原真菌的初步研究[D]. 乔新国.云南大学 2015
本文编号：3522848
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