细胞自噬在电光叶蝉传播水稻瘤矮病毒过程中的功能研究

发布时间：2022-01-05 02:03

　　水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）主要由介体电光叶蝉（Recilia dorsalis）进行传播。近年来关于电光叶蝉与RGDV互作方面的研究相继增多,但在探究电光叶蝉先天免疫机制方面还不多。病毒通过侵染宿主细胞来实现其存活并增殖,自噬作为一种有效的防御途径,可以保护细胞免于受病原微生物的侵害。明确RGDV侵染介体电光叶蝉对细胞自噬反应的影响,可为阐明电光叶蝉传播RGDV的特异性机理提供依据。本研究主要探讨RGDV是否会诱导介体昆虫培养细胞及虫体内的自噬反应,进而影响自身的增殖和扩散,以揭示RGDV与介体昆虫互作的机制。首先分析电光叶蝉转录组中自噬Marker蛋白Atg8的基因和氨基酸序列,设计特异引物克隆Atg8基因全长片段。随后连接至pDEST17原核表达载体,转化Rosetta菌诱导表达,SDS-PAGE后收集目的蛋白条带,免疫小白鼠,制备抗Atg8多克隆抗体,并交联荧光素。接下来利用免疫荧光标记技术在RGDV侵染的电光叶蝉培养细胞中标记自噬蛋白Atg8和RGDV外壳蛋白P8,结果表明,RGDV侵染电光培养细胞可以诱导细胞自噬现象的发生,并且自噬随... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 水稻瘤矮病毒
        1.1.1 水稻瘤矮病的发生、分布和症状
        1.1.2 水稻瘤矮病的寄主植物、病原及传播介体
        1.1.3 水稻瘤矮病毒的基因组结构及功能
    1.2 自噬
        1.2.1 自噬的分类
        1.2.2 自噬的发生过程
        1.2.3 自噬相关基因
        1.2.4 自噬的分子调节机制
        1.2.5 细胞自噬与病毒
    1.3 昆虫培养细胞概况及应用
    1.4 免疫荧光技术
    1.5 本研究的目的及意义
2 实验材料
    2.1 供试材料
        2.1.1 电光叶蝉与水稻瘤矮病株
        2.1.2 感受态、载体和培养细胞
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验仪器设备
3 实验方法
    3.1 自噬相关基因Atg8的多克隆抗体的制备
        3.1.1 引物设计
        3.1.2 电光叶蝉总RNA的提取
        3.1.3 自噬相关基因Atg8的扩增
        3.1.4 入门载体pDONR221-Atg8的构建
        3.1.5 原核表达载体pDEST17-Atg8的构建
        3.1.6 原核表达载体pDEST17-Atg8转入Rosetta (DE3)表达菌株
        3.1.7 自噬相关基因Atg8的原核诱导表达
        3.1.8 抗血清的制备
        3.1.9 Western blot检测抗血清的特异性
        3.1.10 Atg8抗血清的纯化
        3.1.11 Atg8抗体交联荧光素
    3.2 RGDV激活电光叶蝉培养细胞中的自噬现象
        3.2.1 RGDV病毒液的提取
        3.2.2 电光叶蝉单层培养细胞的准备
        3.2.3 RGDV病毒粗提液侵染电光叶蝉单层培养细胞
        3.2.4 免疫荧光标记RGDV侵染的电光叶蝉细胞
        3.2.5 药剂处理RGDV侵染的电光叶蝉培养细胞
        3.2.6 dsRNAs的体外合成
        3.2.7 dsRNAs处理RGDV侵染的电光叶蝉培养细胞
        3.2.8 RT-qPCR检测药剂或dsRNAs处理后细胞中基因表达
    3.3 RGDV激活电光叶蝉虫体中的自噬现象
        3.3.1 免疫荧光观察自噬和RGDV在电光叶蝉的组织定位
        3.3.2 免疫观察dsRN As注射RGDV侵染电光叶蝉虫体中肠内RGDV的积累
        3.3.3 dsRNAs注射RGDV侵染电光叶蝉虫体的RGDV的传播效率
4 结果与分析
    4.1 自噬相关基因Atg8的多克隆抗体的制备
        4.1.1 自噬相关基因Atg8的扩增
        4.1.2 入门载体pDONR221-Atg8的构建
        4.1.3 原核表达载体pDEST17-Atg8的构建
        4.1.4 原核表达载体pDEST17-Atg8转入Rosetta (DE3)菌株
        4.1.5 自噬相关基因Atg8的原核表达
        4.1.6 Western blot检测Atg8抗血清的特异性
    4.2 RGDV侵染激活电光叶蝉培养细胞的自噬现象
        4.2.1 电光叶蝉培养细胞的培养
        4.2.2 RGDV侵染电光叶蝉培养细胞诱导细胞自噬
        4.2.3 自噬促进RGDV在电光叶蝉培养细胞中增殖扩散
    4.3 RGDV激活电光叶蝉虫体中的自噬现象
        4.3.1 电光叶蝉不同组织器官的形态观察
        4.3.2 RGDV侵染电光叶蝉虫体诱导自噬
        4.3.3 自噬促进RGDV在电光叶蝉虫体中增殖扩散
5 讨论
6 小结与展望
参考文献
致谢



本文编号：3569506