柑橘黄龙病菌分泌蛋白S9和S10原核表达及抗血清制备
发布时间：2022-02-15 02:01
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘产业的头号杀手,广泛分布于亚洲、非洲和美洲,且中国11个省（自治区）的300余个县遭受HLB的为害。迄今该病尚无药可治,对柑橘产业已构成严重威胁。其病原系柑橘韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）,其中亚洲柑橘韧皮部杆菌（C.Liberibacter asiaticus,CLas）的侵染性最强,为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播。目前柑橘黄龙病菌纯培养这一世界性难题尚未攻克,对其理化性状的深入研究及病害治理技术的研发存在巨大挑战。自病原菌的全基因组序列2009年公布后,分析表明该病菌具有完整的Sec系统和分泌能力,而分泌蛋白在病原菌致病过程中发挥重要作用,但黄龙病菌分泌蛋白与寄主植物的互作研究还处于初级阶段。制备抗体用于探究病原物与寄主植物的互作是一种较为常用的手段。因此,本研究筛选了CLas的2个分泌蛋白基因,进行原核表达并制备抗血清,为研究这两个分泌蛋白基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学监测分泌蛋白田间表达动态及探究柑橘黄龙病菌分...
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
柑橘黄龙病的典型症状Fig.1.1TypicalsymptomsofCitrusHuanglongbing红鼻果
第3章黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选173.3.2RT-PCR扩增分泌蛋白基因3.3.2.1柑橘黄龙病的检测提取HLB显症叶片主脉的总DNA，利用Jagoueix等[61]报道的HLB特异性引物OI1/OI2c进行PCR检测，扩增得到一条大小1160bp的目的条带（如图3.1），说明检测的样品感染了柑橘黄龙玻采取的赣南脐橙样品呈均匀黄化症状，三红蜜柚样品呈斑驳黄化症状（如图3.2）。图3.1PCR检测田间样品Fig.3.1DetectionoffieldsamplesbyPCRM：DNA分子质量标记；1：双蒸水；2：赣南脐橙样品；3：三红蜜柚样品；4：感染黄龙病植株；5：健康植株M:DNAmolecularweightmarkers;1:ddH2O;2:Gannannavelorange(Citrussinensis)samples;3:Threeredpomelo(C.grandis)samples;4:plantsinfectedwithcitrusHuanglongbing;5:healthyplants图3.2赣南脐橙和三红蜜柚感染黄龙病后的症状Fig.3.2SymptomsofGannannavelorange(Citrussinensis)andThreeredpomelo(C.grandis)infectedwithCitrusHuanglongbingA：赣南脐橙；B：三红蜜柚A:Gannannavelorange;B:Threeredpomelo3.3.2.2RT-PCR结果分泌蛋白基因经过转录再翻译成分泌蛋白，通过提取感病柑橘的RNA，再逆转录，设计初筛分泌蛋白基因引物进行检测，间接验证CLas分泌蛋白是否表达。扩增出S9（158bp）、S10（162bp）片段（如图3.3）。3.3.3分泌蛋白基因的保守性分析结果M12345200015001000750500250100AB
第3章黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选173.3.2RT-PCR扩增分泌蛋白基因3.3.2.1柑橘黄龙病的检测提取HLB显症叶片主脉的总DNA，利用Jagoueix等[61]报道的HLB特异性引物OI1/OI2c进行PCR检测，扩增得到一条大小1160bp的目的条带（如图3.1），说明检测的样品感染了柑橘黄龙玻采取的赣南脐橙样品呈均匀黄化症状，三红蜜柚样品呈斑驳黄化症状（如图3.2）。图3.1PCR检测田间样品Fig.3.1DetectionoffieldsamplesbyPCRM：DNA分子质量标记；1：双蒸水；2：赣南脐橙样品；3：三红蜜柚样品；4：感染黄龙病植株；5：健康植株M:DNAmolecularweightmarkers;1:ddH2O;2:Gannannavelorange(Citrussinensis)samples;3:Threeredpomelo(C.grandis)samples;4:plantsinfectedwithcitrusHuanglongbing;5:healthyplants图3.2赣南脐橙和三红蜜柚感染黄龙病后的症状Fig.3.2SymptomsofGannannavelorange(Citrussinensis)andThreeredpomelo(C.grandis)infectedwithCitrusHuanglongbingA：赣南脐橙；B：三红蜜柚A:Gannannavelorange;B:Threeredpomelo3.3.2.2RT-PCR结果分泌蛋白基因经过转录再翻译成分泌蛋白，通过提取感病柑橘的RNA，再逆转录，设计初筛分泌蛋白基因引物进行检测，间接验证CLas分泌蛋白是否表达。扩增出S9（158bp）、S10（162bp）片段（如图3.3）。3.3.3分泌蛋白基因的保守性分析结果M12345200015001000750500250100AB
【参考文献】：
期刊论文
[1]柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究[J]. 李智鹏,关巍,黄洋,杨玉文,赵廷昌. 果树学报. 2019(11)
[2]植原体致病分子机理研究进展[J]. 李继东,陈鹏,倪静,顾理媛,王会鱼,郑先波,冯建灿. 园艺学报. 2019(09)
[3]重组蛋白微生物表达系统的研究进展[J]. 黄浩,王阳,堵国成,康振. 生物产业技术. 2019(03)
[4]柑橘黄龙病病原CLIBASIA＿03230基因的克隆及其编码蛋白的原核表达[J]. 赵国欢,张小兵,李凡,李为民. 云南农业大学学报(自然科学). 2019(01)
[5]柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因（PAP）序列分析、原核表达及抗血清制备[J]. 李宾宾,余乃通,杨毅,王健华,张秀春,刘志昕. 植物保护. 2019(05)
[6]对柑橘黄龙病防控对策的再思考[J]. 周常勇. 植物保护. 2018(05)
[7]基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析[J]. 李嘉慧,郑正,邓晓玲. 植物病理学报. 2019(03)
[8]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[9]柑橘黄龙病研究进展[J]. 程春振,曾继吾,钟云,闫化学,姜波,钟广炎. 园艺学报. 2013(09)
[10]柑桔黄龙病的诊断方法[J]. 吴世盘,钱菊梅. 植物检疫. 1988(04)
博士论文
[1]稻瘟菌干扰水稻钾离子通道抑制免疫反应的分子机理研究[D]. 史学涛.中国农业科学院 2018
[2]一、稻瘟菌效应子AvrPi9在水稻中互作蛋白的筛选与功能研究 二、组蛋白去乙酰化酶HDT701与Rpp30互作调控水稻免疫反应[D]. 熊叶辉.中国农业科学院 2016
[3]韧皮部杆菌亚洲种简单重复序列（SSR）多态性及其侵染甜橙后转录组学研究[D]. 黄爱军.西南大学 2014
[4]中国柑橘黄龙病病原调查、种群遗传分化及其原噬菌体溶菌酶蛋白原核表达[D]. 苏华楠.西南大学 2013
硕士论文
[1]柑橘黄龙病菌分泌蛋白Clsp33致病机理初步研究[D]. 刘雪禄.西南大学 2019
[2]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的表达纯化及两种重要病原的分子检测[D]. 侯卫真.华中农业大学 2014
[3]中国柑橘黄龙病病原菌原噬菌体遗传多样性研究[D]. 谭锦.西南大学 2013
[4]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的重组表达和纯化[D]. 郝俊.华中农业大学 2011
[5]应用荧光定量PCR技术研究亚洲韧皮部杆菌在寄主体内的动态变化及分布[D]. 胡浩.重庆大学 2007
本文编号：3625689
【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
柑橘黄龙病的典型症状Fig.1.1TypicalsymptomsofCitrusHuanglongbing红鼻果
第3章黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选173.3.2RT-PCR扩增分泌蛋白基因3.3.2.1柑橘黄龙病的检测提取HLB显症叶片主脉的总DNA，利用Jagoueix等[61]报道的HLB特异性引物OI1/OI2c进行PCR检测，扩增得到一条大小1160bp的目的条带（如图3.1），说明检测的样品感染了柑橘黄龙玻采取的赣南脐橙样品呈均匀黄化症状，三红蜜柚样品呈斑驳黄化症状（如图3.2）。图3.1PCR检测田间样品Fig.3.1DetectionoffieldsamplesbyPCRM：DNA分子质量标记；1：双蒸水；2：赣南脐橙样品；3：三红蜜柚样品；4：感染黄龙病植株；5：健康植株M:DNAmolecularweightmarkers;1:ddH2O;2:Gannannavelorange(Citrussinensis)samples;3:Threeredpomelo(C.grandis)samples;4:plantsinfectedwithcitrusHuanglongbing;5:healthyplants图3.2赣南脐橙和三红蜜柚感染黄龙病后的症状Fig.3.2SymptomsofGannannavelorange(Citrussinensis)andThreeredpomelo(C.grandis)infectedwithCitrusHuanglongbingA：赣南脐橙；B：三红蜜柚A:Gannannavelorange;B:Threeredpomelo3.3.2.2RT-PCR结果分泌蛋白基因经过转录再翻译成分泌蛋白，通过提取感病柑橘的RNA，再逆转录，设计初筛分泌蛋白基因引物进行检测，间接验证CLas分泌蛋白是否表达。扩增出S9（158bp）、S10（162bp）片段（如图3.3）。3.3.3分泌蛋白基因的保守性分析结果M12345200015001000750500250100AB
第3章黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选173.3.2RT-PCR扩增分泌蛋白基因3.3.2.1柑橘黄龙病的检测提取HLB显症叶片主脉的总DNA，利用Jagoueix等[61]报道的HLB特异性引物OI1/OI2c进行PCR检测，扩增得到一条大小1160bp的目的条带（如图3.1），说明检测的样品感染了柑橘黄龙玻采取的赣南脐橙样品呈均匀黄化症状，三红蜜柚样品呈斑驳黄化症状（如图3.2）。图3.1PCR检测田间样品Fig.3.1DetectionoffieldsamplesbyPCRM：DNA分子质量标记；1：双蒸水；2：赣南脐橙样品；3：三红蜜柚样品；4：感染黄龙病植株；5：健康植株M:DNAmolecularweightmarkers;1:ddH2O;2:Gannannavelorange(Citrussinensis)samples;3:Threeredpomelo(C.grandis)samples;4:plantsinfectedwithcitrusHuanglongbing;5:healthyplants图3.2赣南脐橙和三红蜜柚感染黄龙病后的症状Fig.3.2SymptomsofGannannavelorange(Citrussinensis)andThreeredpomelo(C.grandis)infectedwithCitrusHuanglongbingA：赣南脐橙；B：三红蜜柚A:Gannannavelorange;B:Threeredpomelo3.3.2.2RT-PCR结果分泌蛋白基因经过转录再翻译成分泌蛋白，通过提取感病柑橘的RNA，再逆转录，设计初筛分泌蛋白基因引物进行检测，间接验证CLas分泌蛋白是否表达。扩增出S9（158bp）、S10（162bp）片段（如图3.3）。3.3.3分泌蛋白基因的保守性分析结果M12345200015001000750500250100AB
【参考文献】：
期刊论文
[1]柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究[J]. 李智鹏,关巍,黄洋,杨玉文,赵廷昌. 果树学报. 2019(11)
[2]植原体致病分子机理研究进展[J]. 李继东,陈鹏,倪静,顾理媛,王会鱼,郑先波,冯建灿. 园艺学报. 2019(09)
[3]重组蛋白微生物表达系统的研究进展[J]. 黄浩,王阳,堵国成,康振. 生物产业技术. 2019(03)
[4]柑橘黄龙病病原CLIBASIA＿03230基因的克隆及其编码蛋白的原核表达[J]. 赵国欢,张小兵,李凡,李为民. 云南农业大学学报(自然科学). 2019(01)
[5]柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因（PAP）序列分析、原核表达及抗血清制备[J]. 李宾宾,余乃通,杨毅,王健华,张秀春,刘志昕. 植物保护. 2019(05)
[6]对柑橘黄龙病防控对策的再思考[J]. 周常勇. 植物保护. 2018(05)
[7]基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析[J]. 李嘉慧,郑正,邓晓玲. 植物病理学报. 2019(03)
[8]革兰阴性菌分泌系统及其分泌产物研究进展[J]. 余乐正,柳凤娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 动物医学进展. 2017(08)
[9]柑橘黄龙病研究进展[J]. 程春振,曾继吾,钟云,闫化学,姜波,钟广炎. 园艺学报. 2013(09)
[10]柑桔黄龙病的诊断方法[J]. 吴世盘,钱菊梅. 植物检疫. 1988(04)
博士论文
[1]稻瘟菌干扰水稻钾离子通道抑制免疫反应的分子机理研究[D]. 史学涛.中国农业科学院 2018
[2]一、稻瘟菌效应子AvrPi9在水稻中互作蛋白的筛选与功能研究 二、组蛋白去乙酰化酶HDT701与Rpp30互作调控水稻免疫反应[D]. 熊叶辉.中国农业科学院 2016
[3]韧皮部杆菌亚洲种简单重复序列（SSR）多态性及其侵染甜橙后转录组学研究[D]. 黄爱军.西南大学 2014
[4]中国柑橘黄龙病病原调查、种群遗传分化及其原噬菌体溶菌酶蛋白原核表达[D]. 苏华楠.西南大学 2013
硕士论文
[1]柑橘黄龙病菌分泌蛋白Clsp33致病机理初步研究[D]. 刘雪禄.西南大学 2019
[2]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的表达纯化及两种重要病原的分子检测[D]. 侯卫真.华中农业大学 2014
[3]中国柑橘黄龙病病原菌原噬菌体遗传多样性研究[D]. 谭锦.西南大学 2013
[4]柑橘黄龙病Serralysin蛋白的重组表达和纯化[D]. 郝俊.华中农业大学 2011
[5]应用荧光定量PCR技术研究亚洲韧皮部杆菌在寄主体内的动态变化及分布[D]. 胡浩.重庆大学 2007
本文编号：3625689
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