Bt Vip3Aa11蛋白羧基端点突变对其杀虫活性和敏感性的影响

发布时间：2023-04-23 07:39

　　苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)营养期杀虫蛋白Vip3A类对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。虽然Vip3Aa蛋白间的序列相似性很高(95%-100%),但是,不同Bt菌株来源的Vip3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性存在很大差异。本研究为了探索Vip3Aa11羧基端点突变对其杀虫活性和敏感性的影响,基于Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白氨基酸序列同源性高而杀虫活性差异大的特点,利用定点突变技术将挑选的位于Vip3Aa11羧基端的九个差异氨基酸分别突变为Vip3Aa39相应位点上的氨基酸。得到九个突变体:S543N、I544L、D547E、T681V、T685I、S686R、R704G、I780L和Y784N。将突变体基因在大肠杆菌(E.coli)BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明九个突变基因和vip3Aa11均在可溶组分中表达大小约88 kDa的蛋白片段。对小菜蛾(Plutella xyllostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、小地老虎(Agrotis ...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 苏云金芽胞杆菌
    1.2 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
        1.2.1 营养期杀虫蛋白的分类
        1.2.2 营养期杀虫蛋白的杀虫活性及作用机理
    1.3 营养期杀虫蛋白的应用
        1.3.1 构建工程菌
        1.3.2 构建转基因植物
    1.4 Bt蛋白质的改造
        1.4.1 定点突变
        1.4.2 结构域互换
        1.4.3 随机诱变
        1.4.4 DNA改组
    1.5 三种重要鳞翅目害虫及其危害
        1.5.1 甜菜夜蛾
        1.5.2 棉铃虫
        1.5.3 小地老虎
    1.6 本研究的立题依据和目的意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 供试昆虫
        2.1.4 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 突变方法
        2.2.2 PCR扩增引物序列
        2.2.3 PCR反应体系
        2.2.4 消化甲基化模板
        2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.6 BL21感受态细胞的制备
        2.2.7 热击转化BL21感受态细胞
        2.2.8 大肠杆菌质粒DNA提取
        2.2.9 序列测定及分析
        2.2.10 蛋白的表达与提取
        2.2.11 SDS-蛋白电泳
        2.2.12 蛋白定量的方法
        2.2.13 生物活性测定
        2.2.14 生测数据分析
        2.2.15 胰蛋白酶消化实验
3 结果与分析
    3.1 含vip3Aa11基因片段的表达载体的构建
    3.2 突变基因的克隆
    3.3 Vip3Aa11与突变体蛋白的表达与分析
    3.4 杀虫活性测定
        3.4.1 初筛
        3.4.2 复筛
    3.5 Vip3Aa11及突变体蛋白对胰蛋白酶的敏感性分析
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3799385