RBOHD的919位谷氨酸调控脂多糖诱导产生活性氧的分子机制

发布时间：2023-04-25 00:44

　　在与微生物长期共同进化过程中,植物形成了一系列的免疫反应抵御病原微生物的侵染。活性氧ROS(Reactive Oxygen Species)迸发是非常重要的免疫反应之一,它不仅可以通过自身的毒害作用抑制病原微生物生长,而且可以作为第二信使介导下游信号转导。脂多糖LPS(Lipopolysaccharide),又称内毒素,是革兰氏阴性菌细胞外膜的糖脂复合物,它是一种重要的微生物相关分子模式MAMP(Microbe-associate Molecular Pattern),可以诱导拟南芥产生双相 ROS 迸发。LPS及其活性成分lipid A诱导的早期ROS迸发和典型的MAMPs诱导的ROS迸发一样,短暂且快速,而后期缓慢且持久的ROS迸发是LPS所特有的。LPS引起的双相ROS迸发是一个全新的MAMPs引起的免疫反应,但双相ROS迸发的分子机制及其作用仍然未知。本研究通过遗传学筛选得到对LPS引起双相ROS迸发不敏感的拟南芥突变体 delt1(Defective inLPS-triggered Late-ROS),通过对 delt1的详细研究解析了 LPS调控双相ROS进发的分子机制。获...

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【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 植物活性氧的产生和清除
        1.1.1 植物活性氧的产生
        1.1.2 植物活性氧的清除
    1.2 NADPH氧化酶的研究进展
        1.2.1 NADPH氧化酶种类
        1.2.2 动物NADPH氧化酶的调控方式
        1.2.3 植物NADPH氧化酶的功能与调控
    1.3 植物免疫反应中活性氧的功能及产生机制
        1.3.1 植物免疫反应中活性氧的功能
        1.3.2 MAMPs诱导植物活性氧的分子机制
        1.3.3 LPS诱导植物产生活性氧的研究进展
    1.4 本研究的目的意义及主要内容
2 DELT1基因的图位克隆及MutMap测序
    2.1 材料与方法
        2.1.1 植物材料与种植方法
        2.1.2 试剂和仪器
        2.1.3 拟南芥杂交
        2.1.4 活性氧(ROS)的检测
        2.1.5 基因组DNA的提取
        2.1.6 图位克隆(Map-Based Cloning)
        2.1.7 MutMap测序技术
    2.2 结果和分析
        2.2.1 delt1突变体对LPS诱导的ROS迸发不敏感
        2.2.2 delt1-1和delt1-2突变体是单基因隐性突变
        2.2.3 DELT1基因的图位克隆
        2.2.4 DELT1基因的MutMap测序
        2.2.5 候选基因的遴选与验证
        2.2.6 杂交互补验证DELT1基因
        2.2.7 delt1-1和delt1-2是功能缺失的突变体
    2.3 本章小结
3 E919K调控活性氧的分子机制
    3.1 材料与方法
        3.1.1 植物材料与种植方法
        3.1.2 试剂和仪器
        3.1.3 菌类材料和质粒载体
        3.1.4 植物RNA提取及cDNA的合成
        3.1.5 实时荧光定量qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)
        3.1.6 拟南芥主根生长的抑制分析
        3.1.7 植物总蛋白的提取
        3.1.8 植物质膜蛋白的提取
        3.1.9 Gateway法克隆基因
        3.1.10 免疫印迹Immunblotting蛋白检测
        3.1.11 蛋白亚细胞定位
        3.1.12 萤火虫荧光素酶互补(LCI)实验
        3.1.13 双分子荧光互补实验(BiFC)实验
        3.1.14 NADPH氧化酶活性测定
        3.1.15 气孔开度实验
    3.2 结果和分析
        3.2.1 E919是NADPH氧化酶非常保守的位点
        3.2.2 RBOHD基因CDS序列碱基G2755突变不影响RBOHD的转录水平
        3.2.3 E919突变不影响RBOHD的亚细胞定位
        3.2.4 E919突变不影响RBOHD自身互作以及和BIK1的互作
        3.2.5 E919突变不影响RBOHD内源蛋白的积累
        3.2.6 E919突变影响RBOHD蛋白的活性
        3.2.7 E919突变不影响lipidA诱导产生的防御相关基因表达
        3.2.8 E919突变不影响lipid A诱导的幼苗主根生长抑制
        3.2.9 E919突变影响lipid A诱导的气孔关闭
    3.3 本章小结
4 全文总结与讨论
参考文献
附录



本文编号：3800360