稻瘟病菌中调控碳代谢阻遏的若干因子分析
发布时间：2023-04-26 04:43
稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Sny.Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是影响粮食生产的主要病害之一,而其单倍体、基因组全序列已测出以及典型的侵染循环等特点使之成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式生物。碳代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)广泛地存在于各种真菌中,环境信号可以激发CCR,从而调控真菌的生长、发育和致病能力,但是通过CCR探究植物与病原真菌的互作关系目前还是较为新颖的切入点。CreA/Cre1是丝状子囊真菌中调控CCR的重要转录因子,是酿酒酵母Mig1的同源物。而与酿酒酵母相比,丝状真菌的CCR调控网络更为复杂,以构巢曲霉为例,除了有CreA这一重要的转录因子外,还存在CreB、CreC、CreD等重要的碳代谢因子。我们实验室之前的研究发现,稻瘟病菌的MoCreA、MoCreC参与CCR,且MoCREA、MoCREC基因的缺失突变体的致病力下降。但是,目前关于稻瘟病菌中碳代谢阻遏的调控网络及其致病机制尚不清晰,需要进一步探究完善。因此,本论文在前期研究的基础上,进一步分析了稻瘟病菌碳代谢调...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 真菌代谢阻遏研究概况
1.2 酿酒酵母中的碳代谢阻遏
1.3 丝状真菌中的碳代谢阻遏
1.4 丝状真菌中关键的CCR调节因子
1.4.1 CreA/Cre1
1.4.2 CreB/Cre2 and CreC
1.4.3 CreD
1.4.4 Snf1
1.5 稻瘟病菌中CCR的研究现状
1.6 本研究的目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 供试菌株和植株
2.1.2 质粒载体
2.1.3 实验培养基
2.1.4 试剂
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学方法
2.2.2 常规PCR体系
2.2.3 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备
2.2.4 大肠杆菌的转化及转化子验证
2.2.5 稻瘟病菌MoHIR3基因敲除方法
2.2.6 MoHir3::GFP融合回补载体构建
2.2.7 稻瘟病菌原生质体的制备
2.2.8 稻瘟病菌原生质体的转化
2.2.9 稻瘟病菌菌丝DNA粗提
2.2.10 稻瘟病菌相关表型分析
2.2.11 CreA::GFP融合自身启动子表达载体构建
2.2.12 提取稻瘟病菌蛋白
2.2.13 Wetern blot
2.2.14 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)
2.2.15 免疫沉淀质谱结果分析
2.2.16 酵母双杂交载体构建
2.2.17 酵母双杂交
3 结果与分析
3.1 MoCreB、MoCreC、MoCreD和MoUbp8相互关系的研究
3.1.1 MoUbp8定位分析
3.1.2 去泛素化酶MoCre B和MoUbp8参与调控CCR
3.1.3 MoCRED/MoUBP8双敲突变体表型分析
3.1.4 若干单敲突变体与双敲突变体的CCR比较分析
3.2 MoHir3的功能分析
3.2.1 MoHIR3生物信息学分析
3.2.2 MoHIR3敲除突变体的获得
3.2.3 MoHIR3的缺失减缓稻瘟病菌的营养生长
3.2.4 MoHIR3的缺失不影响稻瘟病菌的产孢
3.2.5 MoHIR3的缺失使稻瘟病菌丧失致病力
3.2.6 ΔMohir3的附着胞形成被严重阻碍
3.2.7 外源c AMP未能诱导 ΔMohir3附着胞形成
3.2.8 MoHIR3的缺失对稻瘟病菌的敏感性影响较小
3.2.9 MoHir3参与稻瘟病菌的碳代谢阻遏
3.3 MoCre A::GFP免疫沉淀
4 小结与讨论
4.1 泛素化酶MoCre D与去泛素化酶MoUbp8具有相反作用
4.2 MoHir3可能对稻瘟病菌生长、致病及CCR具有重要的作用
4.3 稻瘟病菌中MoCre A调控的CCR有待进一步探究
5 展望
参考文献
附录 表MoCreA免疫沉淀初筛假定互作蛋白
攻读学位期间期间的学术论文与研究成果
致谢
本文编号：3801766
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 真菌代谢阻遏研究概况
1.2 酿酒酵母中的碳代谢阻遏
1.3 丝状真菌中的碳代谢阻遏
1.4 丝状真菌中关键的CCR调节因子
1.4.1 CreA/Cre1
1.4.2 CreB/Cre2 and CreC
1.4.3 CreD
1.4.4 Snf1
1.5 稻瘟病菌中CCR的研究现状
1.6 本研究的目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 供试菌株和植株
2.1.2 质粒载体
2.1.3 实验培养基
2.1.4 试剂
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学方法
2.2.2 常规PCR体系
2.2.3 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备
2.2.4 大肠杆菌的转化及转化子验证
2.2.5 稻瘟病菌MoHIR3基因敲除方法
2.2.6 MoHir3::GFP融合回补载体构建
2.2.7 稻瘟病菌原生质体的制备
2.2.8 稻瘟病菌原生质体的转化
2.2.9 稻瘟病菌菌丝DNA粗提
2.2.10 稻瘟病菌相关表型分析
2.2.11 CreA::GFP融合自身启动子表达载体构建
2.2.12 提取稻瘟病菌蛋白
2.2.13 Wetern blot
2.2.14 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)
2.2.15 免疫沉淀质谱结果分析
2.2.16 酵母双杂交载体构建
2.2.17 酵母双杂交
3 结果与分析
3.1 MoCreB、MoCreC、MoCreD和MoUbp8相互关系的研究
3.1.1 MoUbp8定位分析
3.1.2 去泛素化酶MoCre B和MoUbp8参与调控CCR
3.1.3 MoCRED/MoUBP8双敲突变体表型分析
3.1.4 若干单敲突变体与双敲突变体的CCR比较分析
3.2 MoHir3的功能分析
3.2.1 MoHIR3生物信息学分析
3.2.2 MoHIR3敲除突变体的获得
3.2.3 MoHIR3的缺失减缓稻瘟病菌的营养生长
3.2.4 MoHIR3的缺失不影响稻瘟病菌的产孢
3.2.5 MoHIR3的缺失使稻瘟病菌丧失致病力
3.2.6 ΔMohir3的附着胞形成被严重阻碍
3.2.7 外源c AMP未能诱导 ΔMohir3附着胞形成
3.2.8 MoHIR3的缺失对稻瘟病菌的敏感性影响较小
3.2.9 MoHir3参与稻瘟病菌的碳代谢阻遏
3.3 MoCre A::GFP免疫沉淀
4 小结与讨论
4.1 泛素化酶MoCre D与去泛素化酶MoUbp8具有相反作用
4.2 MoHir3可能对稻瘟病菌生长、致病及CCR具有重要的作用
4.3 稻瘟病菌中MoCre A调控的CCR有待进一步探究
5 展望
参考文献
附录 表MoCreA免疫沉淀初筛假定互作蛋白
攻读学位期间期间的学术论文与研究成果
致谢
本文编号：3801766
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