香蕉穿孔线虫内参基因的筛选及其acatn基因的克隆分析

发布时间：2023-06-03 07:08

　　香蕉穿孔线虫[Radopholus similis(Cobb,1893)Thorne,1949]是一种内寄生植物病原线虫,严重危害多种经济作物以及观赏植物。化学防治是如今对香蕉穿孔线虫最常用的防治方法,但是化学杀线剂的过量使用严重污染环境和危害人类健康,因此以生物技术为策略、以线虫寄生致病基因为靶标的可持续防治该线虫的新方法已成为关注的热点。在靶标基因功能分析研究中,需要根据试验因素选择理想的内参基因进行校正和标准化,保证定量分析的准确性。但是迄今尚未有香蕉穿孔线虫内参基因的研究报道。乙酰辅酶A转运蛋白(Acetyl-coenzyme A transporter,ACATN)是内质网中的多重跨膜蛋白,参与神经节苷脂中唾液酸的O-乙酰化过程。研究香蕉穿孔线虫ACATN有助于获得更多潜在的靶标基因。但是目前尚未有植物寄生线虫ACATN基因(acatn)的报道。本研究利用香蕉穿孔线虫转录组数据库和qPCR技术筛选香蕉穿孔线虫的理想内参基因,并从该数据库中筛选克隆了香蕉穿孔线虫acatn,利用筛选出的内参基因对该acatn进行定量分析,获得的主要研究结果如下:1、利用生物信息学的方法在香蕉穿孔...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 香蕉穿孔线虫研究概况
        1.1.1 香蕉穿孔线虫的分布及其经济重要性
        1.1.2 香蕉穿孔线虫的寄主范围及危害症状
        1.1.3 香蕉穿孔线虫的生物学特性及致病性
        1.1.4 香蕉穿孔线虫的防治措施
    1.2 实时荧光定量PCR概况
        1.2.1 实时荧光定量PCR简介
        1.2.2 实时荧光定量PCR的优越性及应用
        1.2.3 实时荧光定量PCR结果影响因素
    1.3 内参基因及其应用和选择
        1.3.1 内参基因简介
        1.3.2 内参基因稳定性的分析方法
    1.4 乙酰辅酶A转运蛋白研究概况
    1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 供试香蕉穿孔线虫
        2.1.2 菌株和质粒载体
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 主要溶液和培养基的制备
    2.2 方法
        2.2.1 香蕉穿孔线虫的扩繁
            2.2.1.1 胡萝卜愈伤组织的培养
            2.2.1.2 供试香蕉穿孔线虫的分离和扩繁
        2.2.2 香蕉穿孔线虫总RNA的提取
            2.2.2.1 香蕉穿孔线虫不同种群混合虫态总RNA的提取
            2.2.2.2 香蕉穿孔线虫不同虫态RNA的提取
        2.2.3 cDNA的合成
        2.2.4 候选内参基因的挖掘和克隆分析
            2.2.4.1 候选内参基因的挖掘
            2.2.4.2 引物设计
            2.2.4.3 PCR反应
            2.2.4.4 琼脂糖凝胶DNA回收
            2.2.4.5 连接反应
            2.2.4.6 转化
            2.2.4.7 目的片段的测序
        2.2.5 候选内参基因的筛选
            2.2.5.1 引物的设计
            2.2.5.2 普通PCR检测引物
            2.2.5.3 标准曲线的制备
            2.2.5.4 实时荧光定量PCR
            2.2.5.5 数据分析
        2.2.6 香蕉穿孔线虫Rs-acatn-1 基因全长扩增和生物信息学分析
            2.2.6.1 RACE-Ready cDNA的准备
            2.2.6.2 RACE的引物设计
            2.2.6.3 5’RACE和 3’RACE的扩增
            2.2.6.4 基因开放阅读框ORF的获得
            2.2.6.5 Rs-acatn-1 基因DNA序列的获得
            2.2.6.6 Rs-acatn-1 基因序列分析和蛋白功能预测
        2.2.7 Rs-acatn-1 表达量的分析
            2.2.7.1 引物的设计
            2.2.7.2 Rs-acatn-1 基因在不同虫态的表达量
3 结果与分析
    3.1 总RNA提取检测
    3.2 候选内参基因克隆
    3.3 候选内参基因的筛选
        3.3.1 引物特异性分析
            3.3.1.1 普通PCR对引物的检测
            3.3.1.2 候选内参基因溶解曲线的分析
        3.3.2 标准曲线的制备
        3.3.3 候选内参基因表达丰度分析
        3.3.4 候选内参基因稳定性分析
            3.3.4.1 BestKeeper分析
            3.3.4.2 geNorm分析
            3.3.4.3 Norm Finder分析
    3.4 香蕉穿孔线虫Rs-acatn-1 的克隆和分析
        3.4.1 香蕉穿孔线虫Rs-acatn-1 基因的克隆
        3.4.2 Rs-acatn-1 基因ORF的扩增及分析
        3.4.3 Rs-acatn-1 基因组基因编码区的扩增及分析
        3.4.4 香蕉穿孔线虫Rs-ACATN-1 的生物信息学分析
            3.4.4.1 Rs-ACATN-1 的理化性质
            3.4.4.2 Rs-ACATN-1 同源性分析
            3.4.4.3 Rs-ACATN-1 信号肽预测
            3.4.4.4 Rs-ACATN-1 跨膜区预测
    3.5 Rs-acatn-1 表达量分析
4 结论与讨论
    4.1 香蕉穿孔线虫内参基因的筛选
    4.2 Rs-acatn-1 基因的克隆和功能研究
    4.3 研究的创新性和展望
致谢
参考文献
附录



本文编号：3828873