小菜蛾及甜菜夜蛾中肠液中Cry结合蛋白的分离与鉴定

发布时间：2023-06-03 08:39

　　苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性菌,其在芽胞形成阶段产生的Cry毒素是一种对多种农林害虫具有特异杀虫活性的蛋白毒素。Cry毒素对非靶标生物无毒性,其制剂被广泛应用于农林害虫防治以及抗虫转基因作物改造。随着Cry制剂的大量使用,部分田间害虫已对Cry毒素产生抗性,抗性的产生严重妨害了Cry相关制剂的后续应用。因此,深入研究Cry杀虫作用时的分子过程,揭开Cry杀虫机理的全貌,是从根本上解决Bt发展问题的理论基础。目前公认的Cry作用机制模型主要有二种:穿孔模型和信号转导模型。Cry毒素与昆虫中肠刷状缘膜微囊(BBMVs)上受体的结合是Cry毒素发挥杀虫功能的关键步骤。至今有报道的BBMVs受体包括碱性磷酸酶(ALP)、氨肽酶N(APN)、钙黏蛋白(CAD)、ABCC2转运蛋白以及最新发现的V-ATPase亚基B。然而,昆虫中肠肠腔液中是否存在能够与Cry毒素结合的可溶性蛋白,以及其可能存在的对Cry杀虫过程的影响,还未有报道。因此本研究从昆虫中肠肠腔液中可溶性Cry毒素非受体结合蛋白的新角度,研究Cry毒素杀虫的分子过程。本研究克隆表达...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 Cry毒素
        1.1.1 Cry毒素的空间结构
        1.1.2 Cry毒素的Domain I
        1.1.3 Cry毒素的Domain II
        1.1.4 Cry毒素的Domain III
    1.2 Cry毒素的杀虫机理模型
        1.2.1 Cry毒素的穿孔机制模型
        1.2.2 Cry毒素的信号转导模型
    1.3 Cry毒素结合蛋白的鉴定
        1.3.1 碱性磷酸酶（ALP）
        1.3.2 氨肽酶N（APN）
        1.3.3 钙黏蛋白（CAD）
        1.3.4 ABC转运蛋白家族（ABC transporter）
        1.3.5 其他Cry毒素的结合蛋白
    1.4 研究目的与意义
    1.5 研究内容
        1.5.1 甜菜夜蛾与小菜蛾中肠液中Cry结合蛋白的分离
        1.5.2 甜菜夜蛾与小菜蛾中肠液中Cry结合蛋白的鉴定
        1.5.3 甜菜夜蛾与小菜蛾中肠液中Cry结合蛋白的理论结合验证
        1.5.4 甜菜夜蛾与小菜蛾中肠液中Cry结合蛋白的克隆、表达及纯化
        1.5.5 Cry7Ab4毒素活性区的表达及纯化
第2章 材料与方法
    2.1 甜菜夜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的分离与鉴定
        2.1.1 供试昆虫及Cry毒素
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器和器材
        2.1.4 甜菜夜蛾中肠液的提取
        2.1.5 甜菜夜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的Pull-down Essay
        2.1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Pull-down essay
        2.1.7 蛋白条带的LS-MS/MS鉴定
        2.1.8 Discovery Studio 2.5 分子对接
        2.1.9 蛋白质序列比对及空间结构比对
    2.2 小菜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的分离与鉴定
        2.2.1 供试昆虫与Cry毒素
        2.2.2 主要试剂、仪器和器材
        2.2.3 小菜蛾中肠液的提取
        2.2.4 小菜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的Pull-down Essay
        2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Pull-down essay
        2.2.6 蛋白条带的LS-MS/MS鉴定
    2.3 甜菜夜蛾中肠液Cry结合蛋白POXC的表达及纯化
        2.3.1 菌株和质粒
        2.3.2 主要试剂
        2.3.3 主要仪器
        2.3.4 主要培养基
        2.3.5 主要溶液的配制
        2.3.6 Sepoxc基因克隆载体的构建
        2.3.7 Sepoxc基因表达载体的构建
        2.3.8 Sepoxc基因的诱导表达及纯化
    2.4 小菜蛾中肠液Cry结合蛋白Dorsal的表达及纯化
        2.4.1 菌株和质粒
        2.4.2 主要试剂及仪器
        2.4.3 Pxdorsal基因克隆载体及表达载体的构建
        2.4.4 pGEX-Dorsal质粒在BL21(DE3)中的诱导表达
    2.5 Cry7Ab4毒素活性区的表达及纯化
        2.5.1 菌株和质粒
        2.5.2 主要试剂及仪器
        2.5.3 Cry7Ab4基因活性区克隆载体的构建
        2.5.4 Cry7Ab4基因活性区表达载体的构建
        2.5.5 Cry7Ab4基因的诱导表达及纯化
第3章 结果与分析
    3.1 甜菜夜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白的分离与鉴定
    3.2 甜菜夜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白SePOXC的克隆、表达与纯化
        3.2.1 Sepoxc全基因合成及克隆载体的构建
        3.2.2 Sepoxc基因表达载体的构建
        3.2.3 Sepoxc基因的诱导表达
        3.2.4 蛋白浓度标准曲线
        3.2.5 SePOXC蛋白的纯化
    3.3 小菜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白的分离与鉴定
    3.4 小菜蛾dorsal基因的克隆、表达及纯化
        3.4.1 Pxdorsal全基因合成及克隆载体及表达载体的构建
        3.4.2 Pxdorsal基因的诱导表达
        3.4.3 PxDorsal蛋白的纯化
    3.5 Cry7Ab4基因的表达
        3.5.1 Cry7Ab4基因活性区克隆载体的构建
        3.5.2 Cry7Ab4基因活性区表达载体的构建
        3.5.3 Cry7Ab4基因的诱导表达
第4章 讨论
    4.1 小菜蛾Dorsal与昆虫免疫反应
    4.2 甜菜夜蛾POXC功能的推测
    4.3 Cry7Ab4毒素及其结合蛋白的分离鉴定
    4.4 结论与后续工作
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3829005