辣椒溶杆菌GntR家族转录调节基因在菌株X2-3生物膜形成及抗逆性中的功能分析

发布时间：2023-06-03 12:02

　　辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)X2-3是本实验室从小麦根际土壤中分离得到的一株溶杆菌菌株,对多种植物病原真菌和卵菌具有明显的拮抗活性。该菌株菌落表面光滑,GC%含量高,具有很强的滑动性。本研究以L.capsici X2-3为出发菌株,构建了X2-3转座子随机插入突变体库,从突变体库中筛选生物膜表型变化的突变株,并对突变体MT4的相关基因功能进行了分析。取得的主要研究结果如下:1.随机插入突变体库构建利用Tn5随机插入法对X2-3进行转座诱变,获得了4800余个插入突变体。以生物膜表型特征为依据,筛选得到了7株生物膜表型变化的突变株,分别命名为MT1-MT7。通过质粒拯救法,确定了Tn5在不同突变体中插入的目的基因位点,其中3个突变株插入位点在同一个基因LC0409,其余4个突变体插入位点分别在基因LC3417,LC3753,LC4356和LC0306。2.突变体MT4插入基因的功能预测对突变株MT4插入基因在GenBank中比对分析,发现,该基因编码GntR家族转录调控因子,其氨基酸序列与辣椒溶杆菌L.capsici(ID:ALN83455)氨基酸序列相似性达到10...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
英文缩略词及中文对照表
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 溶杆菌的研究进展
        1.1.1 溶杆菌属的分类地位
        1.1.2 溶杆菌属的生物学特性
        1.1.3 辣椒溶杆菌(L.capsici)的研究进展
    1.2 转座子插入突变
        1.2.1 转座子
        1.2.2 侧翼序列的获得
            1.2.2.1 Plasmid rescue(质粒拯救)技术
            1.2.2.2 IPCR(Inverse PCR)技术
            1.2.2.3 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interiaced PCR)技术
            1.2.2.4 PCR-Walking(PCR步移)技术
        1.2.3 转座子插入突变在细菌功能研究中的应用
    1.3 细菌生物膜
        1.3.1 生物膜形成过程
        1.3.2 生物膜结构和组成
        1.3.3 生物膜的作用
    1.4 GntR家族转录调控因子
        1.4.1 GntR家族转录调控因子的特性
        1.4.2 GntR家族转录调控因子的功能
    1.5 本研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 培养基
        2.1.3 主要实验仪器
        2.1.4 酶与试剂
        2.1.5 引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 电转感受态细胞的制备及转化
            2.2.1.1 电转感受态细胞的制备
            2.2.1.2 感受态细胞的电转化
        2.2.2 突变体的筛选及质粒拯救法鉴定侧翼序列
            2.2.2.1 突变体的筛选
            2.2.2.2 突变体生物膜表面形态变化的验证
            2.2.2.3 细菌基因组DNA提取
            2.2.2.4 PCR验证
            2.2.2.5 基因组DNA的酶切
            2.2.2.6 酶切产物的纯化
            2.2.2.7 纯化酶切产物的连接
            2.2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
            2.2.2.9 质粒DNA的小量提取
            2.2.2.10 转化
        2.2.3 突变体突变基因功能互补
            2.2.3.1 突变基因的获得
            2.2.3.2 PCR产物的回收
            2.2.3.3 重组载体Blunt-4356 的构建及验证
            2.2.3.4 重组载体Blunt-4356 的酶切和回收
            2.2.3.5 表达载体pBBR1MCS-5 的酶切和回收
            2.2.3.6 重组表达载体PBBR1-4356 的构建及验证
            2.2.3.7 重组表达载体PBBR1-4356 与突变菌株的电转化
            2.2.3.8 LC4356 基因互补突变体的筛选
        2.2.4 荧光定量PCR
            2.2.4.1 RNA的提取
            2.2.4.2 反转录合成c DNA
            2.2.4.3 荧光定量PCR扩增
            2.2.4.4 数据分析
        2.2.5 野生株、突变株和回复株的表型及活性分析
            2.2.5.1 生长曲线的测定
            2.2.5.2 生物膜的测定
            2.2.5.3 抑菌活性的测定
            2.2.5.4 胞外多糖的测定
            2.2.5.5 滑动性的测定
            2.2.5.6 抗逆性的测定
3 结果与分析
    3.1 突变体的筛选和验证
        3.1.1 突变体的筛选
        3.1.2 突变体的验证
        3.1.3 突变体侧翼序列的确认
    3.2 突变体MT4 的插入基因及生物学特性
        3.2.1 LC4356 基因的分析
        3.2.2 突变体和野生株菌落形态的变化
        3.2.3 突变体和野生株生物膜产量的变化
        3.2.4 突变体和野生株抑菌活性的变化
    3.3 突变体MT4 突变基因互补
        3.3.1 LC4356 基因的PCR扩增
        3.3.2 重组载体的构建
        3.3.3 重组表达载体PBBR1-4356 的酶切
        3.3.4 回复菌株MCS-4356 的筛选及验证
    3.4 GntR对上游基因的转录调控分析
        3.4.1 菌株RNA提取
        3.4.2 反转录成c DNA
        3.4.3 荧光定量PCR
    3.5 野生株和突变株生物膜及生物学特性变化
        3.5.1 GntR的突变对生长的影响
        3.5.2 GntR的突变对生物膜产量的影响
        3.5.3 GntR的突变对胞外多糖产量的影响
        3.5.4 GntR的突变对运动性的影响
        3.5.5 野生株与突变株抗逆性的比较
4 讨论
    4.1 EZ-Tn5 随机插入突变体的筛选和侧翼序列分析
    4.2 LC4356 基因回复菌株的构建
    4.3 突变体生物学相关特性及抗逆性的研究
    4.4 GntR家族基因LC4356对其上游基因的调节作用
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间论文发表情况



本文编号：3829301