水稻条斑病菌内源质粒分析与穿梭质粒载体的构建

发布时间：2023-07-25 04:03

　　细菌质粒是独立于染色体外可自主复制的遗传物质,大多为环状双链DNA分子。质粒上往往携带有抗生素抗性、重金属抗逆性及功能蛋白分泌系统等功能相关基因,可帮助宿主菌适应生存环境;而质粒的自主复制与转移能力又使其具备作为基因工程载体的潜力。基因工程载体在黄单胞菌的致病机理研究及黄原胶、胞外蛋白酶的合成研究中均有着至关重要的作用。本研究以水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzcola,Xoc)为研究对象,基于水稻条斑病菌中首个被发现的内源质粒pXOCgx01的序列信息,开展了质粒普查分析和基因工程载体的构建工作。1.在257株来自全国不同地区的分离株中共普查得到9种质粒,分别命名为 pXOCgx02、pXOCB116、pXOCB209、pXOCB216、pXOCB220、pXOCB409、pXOC709、pXOC820 和 pXOC905。对普查到的质粒进行功能鉴定,结果发现:pXOCB209可能具有重金属抗逆性、转座基因及IV型分泌系统,pXOCgx02和pXOC905可能具有IV型分泌系统,pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220可能携带转座基因,而p...

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 黄单胞菌
        1.1.1 水稻条斑病菌
        1.1.2 水稻条斑病菌分离株Xoc GX01
        1.1.3 水稻条斑病菌致病因子
    1.2 黄单胞菌中质粒研究进展
        1.2.1 细菌质粒
        1.2.2 黄单胞菌属细菌内源质粒的研究进展
        1.2.3 水稻条斑病菌内源质粒pXOCgx01的发现
        1.2.4 水稻条斑病菌内源质粒pXOCgx01上的功能基因
    1.3 质粒载体
        1.3.1 质粒载体研究进展
        1.3.2 质粒载体的基本特性
        1.3.3 表达载体
        1.3.4 实验室常用质粒载体
    1.4 本研究的主要内容、目的和意义
        1.4.1 本研究的主要内容
        1.4.2 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 研究所用菌株
        2.1.2 研究所用质粒
        2.1.3 研究所用引物
        2.1.4 研究所用抗生素及配制
        2.1.5 研究所用培养基及配制
        2.1.6 研究所用酶制剂、药品试剂及耗材
        2.1.7 研究所用试剂及配置方法
        2.1.8 研究所用植株
    2.2 常规微生物学操作
        2.2.1 菌株的活化、培养及保存
        2.2.2 生理生化表型检测
        2.2.3 感受态细胞的制备
        2.2.4 感受态细胞的转化实验
        2.2.5 菌株构建实验
    2.3 常规分子生物学操作
        2.3.1 细菌基因组总DNA的提取
        2.3.2 质粒DNA的提取
        2.3.3 DNA的纯化
        2.3.4 酶切与连接
        2.3.5 PCR
        2.3.6 质粒载体末端去磷酸化
        2.3.7 琼脂糖凝胶电泳
    2.4 Tn5插入与克隆质粒拯救
        2.4.1 Tn5插入反应
        2.4.2 转化阳性克隆子筛选
        2.4.3 插入位点定位
第三章 结果与分析
    3.1 水稻条斑病菌中国分离株内源质粒分析
        3.1.1 含内源质粒的Xoc中国分离株普查
        3.1.2 重金属抗逆性相关基因的分析
        3.1.3 转座相关基因的分析
        3.1.4 T4SS相关基因的分析
        3.1.5 Xoc中国分离株内源质粒普查与功能基因分析结果汇总
    3.2 质粒载体的构建
        3.2.1 pXOCgx01插入Tn5
        3.2.2 获得重组质粒pXTR14k
        3.2.3 初步验证pXTR14k的表达能力
        3.2.4 构建质粒载体pXUC2
        3.2.5 质粒载体中间体pXUC2表达能力验证
        3.2.6 替换抗性筛选标记,得到最终质粒载体pXUG、pXUK
    3.3 穿梭质粒载体的应用
        3.3.1 穿梭质粒载体pXUG在黄单胞菌中的应用
        3.3.2 穿梭质粒载体pXUK在黄单胞菌中的应用
        3.3.3 质粒载体稳定性验证
第四章 总结与讨论
    4.1 研究总结
        4.1.1 Xoc中国分离株中内源质粒的普查
        4.1.2 其它水稻条斑病菌内源质粒的功能基因
        4.1.3 质粒载体的构建和功能特点
        4.1.4 质粒载体的表达能力
    4.2 讨论与展望
        4.2.1 质粒及其功能基因的普查
        4.2.2 质粒载体的构建
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3837126