家蚕羧酸酯酶Bmae42抗BmNPV研究

发布时间：2023-09-21 20:16

　　家蚕是继果蝇和按蚊之后的又一个全基因组测序的昆虫,是一种重要的经济和模式生物。中国的蚕茧、蚕丝产量均居世界首位,但是在蚕业生产上总是遇到一种传染病的影响,每年造成巨大损失,该病由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)感染。本课题组前期对我国344个家蚕品种资源进行了抗病鉴定,发现了一个高抗BmNPV的地方种,其半致死剂量是感病品系家蚕的1000倍以上。经过10多年的培育筛选到一个高抗品系NB,再利用杂交和回交的方法,构建了感病品系306的近等基因系BC8。遗传分析表明NB对BmNPV的抗性表现出显性单基因控制的遗传规律。利用高抗品系NB,通过第二代高通量测序技术筛选了与抗性基因相关的多态性分子标记,并利用遗传群体对多态性分子标记与抗性基因的连锁性进行了分析,将抗性基因定位于家蚕第23号染色体上一段区域。对该区域潜在的22个基因进行序列分析,发现了一种羧酸酯酶基因—α-酯酶-42(α-esterases42),与感性品种家蚕相比在抗性品系家蚕中出现了突变。羧酸酯酶(Carboxylesterases)属于多功能超家族...

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 抗BmNPV的研究进展
        1.1.1 BmNPV的研究进展
        1.1.2 已经分离和鉴定得到的抗BmNPV基因
        1.1.3 抗BmNPV家蚕品种的发现和鉴定
        1.1.4 利用RNA干扰和CRISP/Cas9技术研究家蚕抗BmNPV
    1.2 羧酸酯酶的研究概况
        1.2.1 羧酸酯酶基因的分类和命名
        1.2.2 羧酸酯酶的分布与功能
        1.2.3 羧酸酯酶结构特点和催化原理
        1.2.4 昆虫羧酸酯酶与抗药性
        1.2.5 羧酸酯酶与抗病毒
    1.3 研究目的及意义
    1.4 研究主要内容与技术路线
        1.4.1 主要研究内容
        1.4.2 技术路线
第二章 家蚕羧酸酯酶基因Bmae42的生物信息学分析
    2.1 实验方法
        2.1.1 序列的来源及获取
        2.1.2 序列分析及处理方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 Bmae42染色体定位和信号肽的预测
        2.2.2 Bmae42基因的序列分析及N-糖基化位点预测
        2.2.3 Bmae42与其它物种同源性分析及进化树的构建
        2.2.4 Bmae42蛋白的三维结构
    2.3 讨论与小结
第三章 家蚕羧酸酯酶Bmae42基因的克隆和转录时相分析
    3.1 材料和试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 常用试剂配方
        3.1.4 主要仪器设备
    3.2 主要方法
        3.2.1 总RNA提取和cDNA合成
        3.2.2 Bme42基因的引物设计和克隆
        3.2.3 PCR产物回收和连接
        3.2.4 转化
        3.2.5 阳性克隆的挑选和验证
        3.2.6 阳性克隆菌的质粒抽提和鉴定
        3.2.7 荧光定量PCR
    3.3 结果和分析
        3.3.1 家蚕Bmae42基因全长克隆和鉴定
        3.3.2 家蚕Bmae42基因在不同发育时期的转录时相分析
        3.3.3 家蚕Bmae42基因在不同组织中的转录时相分析
    3.4 讨论和小结
第四章 家蚕Bmae42基因的原核表达与多克隆抗体制备
    4.1 试剂和材料
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 常用试剂配方
        4.1.4 主要仪器设备
    4.2 主要方法
        4.2.1 家蚕Bmae42基因重组表达载体的构建
        4.2.2 家蚕基因Bmae42的原核表达及鉴定
        4.2.3 Western Blot
        4.2.4 融合蛋白存在形式检测方法
        4.2.5 包涵体复性方法
        4.2.6 包涵体蛋白纯化方法
        4.2.7 Bmae42蛋白纯化方法
        4.2.8 多克隆抗体血清的制备与纯化
    4.3 结果与分析
        4.3.1 Bmae42基因的原核表达载体鉴定
        4.3.2 重组蛋白 306-Bmae42的原核表达
        4.3.3 重组蛋白的纯化
        4.3.4 Bmae42-pET28a-sumo重组质粒鉴定
        4.3.5 目的蛋白纯化
        4.3.6 不同品种家蚕羧酸酯酶Bmae42的活性分析
        4.3.7 多克隆抗体制备和验证
    4.4 讨论和小结
第五章 BmNPV感染家蚕对Bmae42基因转录水平的影响
    5.1 主要材料
    5.2 主要方法
        5.2.1 BmNPV多角体病毒的繁殖与纯化
        5.2.2 家蚕接种病毒及取材
        5.2.3 内参基因筛选及引物设计
        5.2.4 RNA提取、cDNA合成、荧光定量PCR及标准曲线绘制
        5.2.5 内参基因稳定性分析方法
        5.2.6 抗病基因荧光定量PCR引物设计
    5.3 结果与分析
        5.3.1 NormFinder分析结果
        5.3.2 geNorm分析结果
        5.3.3 BestKeeper结果
        5.3.4 α-tubulin的蛋白表达水平
        5.3.5 BmNPV感染家蚕对其它免疫通路基因的影响
        5.3.6 BmNPV感染家蚕对羧酸酯酶Bmae42基因转录水平的影响
    5.4 讨论与小结
第六章 Bmae42的抗BmNPV侵染分析
    6.1 试剂和材料
        6.1.1 主要材料
        6.1.2 实验试剂
        6.1.3 常用试剂配方
    6.2 主要方法
        6.2.1 细胞培养和病毒感染
        6.2.2 质粒构建
        6.2.3 Guide-RNA设计
        6.2.4 体外检测靶点效率
    6.3 结果与分析
        6.3.1 瞬时表达 Bmae42 对 BmNPV 增殖的影响
        6.3.2 gRNA靶点设计
        6.3.3 体外gRNA靶点效率检测
        6.3.4 敲除Bmae42对BmNPV增殖的影响
    6.4 讨论与小结
第七章 总结与展望
    7.1 主要工作总结
    7.2 工作展望
参考文献
致谢
在校期间发表论文
参与科研项目



本文编号：3848322