水稻干尖线虫miRNA高通量测序分析及内参基因的筛选

发布时间：2023-10-29 13:19

　　水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)是危害水稻的最重要病原线虫之一,分布于世界大多数的水稻种植区,在国内则广泛分布于大陆24省,目前在环渤海稻区发生较为普遍,其不仅危害水稻,还为害草莓、菊花等多种观赏植物和经济作物,造成重大经济损失。目前对于水稻干尖线虫的防治仍以使用杀线剂为主,对环境造成了污染,影响人类的生命健康。随着基因工程技术的快速发展,分子生物学方法成为研究植物线虫防治新方法的重要手段和途径。本研究对水稻干尖线虫致病力不同的N10群体(寄主为水稻)和S24群体(寄主为草莓)进行了miRNA高通量测序和分析,并克隆和筛选了水稻干尖线虫的理想内参基因,研究了这两个群体线虫的miRNA差异表达谱及4个高表达miRNA(miR-1、miR-34、miR-71和let-7-5p)在不同虫态的相对表达情况,对测序结果进行了生物信息学分析;并通过qPCR、原位杂交和miRNA mimics等方法初步研究了水稻干线虫部分miRN A的功能。主要研究成果如下:1、获得了水稻干尖线虫的miRNA测序结果和miRN A表达谱等信息;分别在N10和S24文库中得到了817和73...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩写词及英汉对照
1 前言
    1.1 水稻干尖线虫及其发生概况
    1.2 miRNA概述
        1.2.1 miRNA的发现
        1.2.2 miRNA的特点
        1.2.3 miRNA的生物功能
    1.3 miRNA的鉴定和检测方法
        1.3.1 miRNA的鉴定
        1.3.2 miRNA的实验验证
    1.4 内参基因研究进展
    1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 供试线虫
        2.1.2 供试植物材料
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要试剂
    2.2 方法
        2.2.1 水稻干尖线虫的培养与分离
            2.2.1.1 胡萝卜愈伤组织的制备和水稻干尖线虫的扩繁
            2.2.1.2 胡萝卜愈伤组织上的水稻干尖线虫分离
        2.2.2 两个线虫群体miRNA高通量测序及分析
            2.2.2.1 总RNA的提取
            2.2.2.2 高通量测序
            2.2.2.3 生物信息学分析
        2.2.3 miRNA高通量测序的验证和分析
            2.2.3.1 两个群体间的差异miRNA选择
            2.2.3.2 不同虫态间的miRNA表达分析
            2.2.3.3 qPCR数据分析
            2.2.3.4 miRNA原位杂交
        2.2.4 水稻干尖线虫qPCR内参基因的克隆及筛选
            2.2.4.1 供试线虫样品的收集
            2.2.4.2 总RNA的提取与检测
            2.2.4.3 cDNA第一链合成
            2.2.4.4 候选内参基因片段的克隆和分析
            2.2.4.5 候选内参基因的qPCR引物设计
            2.2.4.6 候选内参基因的qPCR反应
            2.2.4.7 标准曲线的绘制及基因扩增效率
            2.2.4.8 数据分析
        2.2.5 miRNA靶基因的功能预测
        2.2.6 水稻干尖线虫miR-34 的靶基因验证
            2.2.6.1 供试线虫和试剂
            2.2.6.2 线虫的收集、处理及回收
            2.2.6.3 miR-34 靶基因的荧光定量PCR检测及分析
3 结果与分析
    3.1 水稻干尖线虫总RNA的提取结果
    3.2 水稻干尖线虫高通量测序结果及生物信息学分析
        3.2.1 原始测序数据
        3.2.2 两文库小RNA共有和特有序列分析
        3.2.3 Rfam数据库比对
        3.2.4 小RNA分类注释
        3.2.5 已知miRNA和新miRN A的鉴定
            3.2.5.1 已知miRNA的鉴定
            3.2.5.2 新miRNA的预测
        3.2.6 miRNA差异表达分析
        3.2.7 两个群体间的差异miRNA验证
        3.2.8 水稻干尖线虫N10和S24群体不同虫态间miRNA表达分析
        3.2.9 水稻干尖线虫miR-34 原位杂交分析结果
    3.3 水稻干尖线虫qPCR内参基因的克隆及筛选
        3.3.1 总RNA质量检测
        3.3.2 候选内参基因片段克隆及分析
        3.3.3 候选内参基因qPCR的引物分析
        3.3.4 候选内参基因qPCR表达
        3.3.5 内参基因的稳定性
            3.3.5.1 ΔCt法分析
            3.3.5.2 geNorm分析
            3.3.5.3 NormFinder分析
            3.3.5.4 RefFinder分析结果
    3.4 miRNA靶基因预测及功能分析
    3.5 miRNA mimics处理后水稻干尖线虫miR-34 和其靶基因的qPCR分析
        3.5.1 miRNA mimics处理后的miR-34 的qPCR分析
        3.5.2 miRNA mimics处理后的靶基因的qPCR分析
4 结论与讨论
    4.1 水稻干尖线虫N10和S24群体高通量测序及生物信息学分析
    4.2 水稻干尖线虫N10和S24文库miRNA的qPC R验证及分析
    4.3 水稻干尖线虫的内参基因筛选
    4.4 水稻干尖线虫miRNA靶基因的分析
    4.5 miR-34 mimics处理水稻干尖线虫的可行性
    4.6 本研究的创新性及意义
致谢
参考文献
附录A miR-34预测的252个靶基因及其KEGG注释结果
附录B miR-34靶基因的KEGG富集结果



本文编号：3858158