香蕉枯萎病菌4号小种在土壤中的存活特征及与微生物的关系

发布时间：2023-12-05 19:44

　　香蕉(Musa spp.)属芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa),是世界上重要的水果之一,世界上栽培香蕉的国家有130多个,以中美洲产量最多,其次是亚洲。香蕉枯萎病是由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)引起的一种非常严重的土传病害,患病焦园香蕉存活率低,甚至绝收,对香蕉产业的发展造成严重的危害。因此本研究从土壤着手,试图通过研究病原菌在土壤中的成活特征及与微生物的关系,从而明确病原菌在土壤中的流行学规律,为有效防控病害奠定基础。本研究选取了五种不同发病程度的香蕉园土壤(A:种植蔬菜5年后轮作粉蕉;B:种植韭菜5年后轮作粉蕉;C:种植甘蔗4年后轮作粉蕉;D:种植粉蕉后轮作香蕉;E:种植粉蕉后轮作香蕉),通过人工接入同一浓度的香蕉枯萎病4号生理小种,制作成玻片,分别在接种0 d、10 d、20 d、30 d观察香蕉枯萎病4号生理小种在不同土壤中的生长发育情况;然后通过对人工接菌后的土壤,采用荧光定量PCR的方法、平板计数方法以及高通量测序法,系统分析和比较枯萎病菌在不同类型土壤中的变化规律、以及土壤中各类真菌和细菌的多样性和群落结...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩写词及英汉对照
1. 前言
    1.1 香蕉枯萎病概述
        1.1.1 香蕉枯萎病的基本特征
        1.1.2 香蕉枯萎病的致病机理
        1.1.3 香蕉枯萎病田间防治方法
    1.2 香蕉枯萎病菌的检测方法
        1.2.1 实时荧光定量PCR检测原理
        1.2.2 实时荧光定量PCR定量方法的应用
    1.3 土壤微生物多样性的研究
        1.3.1 传统土壤微生物多样性研究方法
        1.3.2 分子生物学研究方法及其应用
    1.4 病原微生物在土壤中的研究
        1.4.1 病原微生物在土壤中存活状态
        1.4.2 土壤微生物物种和结构多样性
    1.5 本研究的目的和意义
2. 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 供试土壤及菌株
        2.1.2 主要试剂及试剂盒
        2.1.3 培养基及试剂配方
        2.1.4 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 土壤理化性质的测定
        2.2.2 土壤中FOC4分生孢子玻片的制作
        2.2.3 引物
        2.2.4 实时荧光定量PCR标准曲线的制作
            2.2.4.1 香蕉枯萎病4号生理小种基因组DNA的提取
            2.2.4.2 PCR扩增目的基因
            2.2.4.3 PCR产物的回收纯化
            2.2.4.4 回收DNA片段与PMD18-T载体的连接
            2.2.4.5 大肠杆菌DH5a热击感受态细胞的制备
            2.2.4.6 重组质粒转化及转化子筛选
            2.2.4.7 质粒DNA的提取
            2.2.4.8 标准曲线的绘制
        2.2.5 土壤中FOC4总DNA的提取
            2.2.5.1 接种土壤微生物总DNA的提取
            2.2.5.2 原始土壤微生物总DNA的提取
            2.2.5.3 普通PCR检测接种FOC4土壤中微生物DNA
        2.2.6 检测接种FOC4土壤及原始土壤中的带菌量
            2.2.6.1 平板计数法检测土壤带菌量
            2.2.6.2 定量PCR检测土壤带菌量
        2.2.7 带菌土壤微生物的高通量测序分析
            2.2.7.1 土壤微生物总DNA的提取
            2.2.7.2 PCR扩增
            2.2.7.3 土样的 16S rDNA和ITS-rDNA的高通量测序
            2.2.7.4 生物信息学分析
3.结果
    3.1 土壤理化性质的测定
    3.2 病菌分生孢子在五种不同土壤中的生长特征
    3.3 实时荧光定量测定土壤中FOC4的数量
        3.3.1 土壤总DNA的提取
        3.3.2 实时荧光定量PCR标准曲线的制作
        3.3.3 FOC4在接种前的土壤中的定量分析
        3.3.4 FOC4在接种 0 d的土壤中的定量分析
        3.3.5 FOC4在接种 10 d的土壤中的定量分析
        3.3.6 FOC4在接种 20 d的土壤中的定量分析
        3.3.7 FOC4在接种 30 d的土壤中的定量分析
    3.4 平板计数法测定不同时间段五种土壤接种FOC4的含量分析
    3.5 带菌土壤微生物高通量测序分析
        3.5.1 PCR扩增结果分析
        3.5.2 高通量测序分析不同时间段五种土壤细菌和真菌群落结构多样性
            3.5.2.1 OTU丰度分析
            3.5.2.2 OTU稀释曲线
            3.5.2.3 样品复杂度（Alpha diversity）分析
            3.5.2.4 OTU shannon稀释曲线
            3.5.2.5 OTU Rank Abundance曲线
            3.5.2.6 OTU主成成分分析
            3.5.2.7 OTU水平上的相似性分析
        3.5.3 物种分类表达谱
            3.5.3.1 细菌群落的物种分类表达谱
            3.5.3.2 真菌群落物种分类表达谱
        3.5.4 土壤群落结构多样性分析
            3.5.4.1 细菌群落结构多样性分析
            3.5.4.2 真菌群落多样性分析
        3.5.5 土壤群落结构Heatmap图分析
            3.5.5.1 土壤细菌群落结构的Heatmap图
            3.5.5.2 土壤真菌群落结构的Heatmap图
        3.5.6 土壤群落结构主成成分分析
            3.5.6.1 土壤细菌群落主成成分分析
            3.5.6.2 土壤真菌群落主成成分分析
4.结论与讨论
    4.1 分生孢子不同时间段生存状态的观察
    4.2 计数结果分析
        4.2.1 实时荧光定量PCR定量结果分析
        4.2.2 平板计数分析
    4.3 微生物高通量测序分析
        4.3.1 土壤样品细菌群落结构多样性分析
        4.3.2 土壤样品真菌群落结构多样性分析
    4.4 结论
致谢
参考文献



本文编号：3870790