尖孢镰刀菌毒素缺陷型菌株的构建及其与灭活菌体防治西瓜连作障碍的研究

发布时间：2024-05-12 04:58

　　西瓜枯萎病是西瓜栽培中常见的土传病害,由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)侵染所致,已成为西瓜生产的主要限制因素。镰刀菌酸(Fusaric acid)是一种镰刀菌属都可以分泌的非特异性毒素,是FON分泌的主要毒素。本研究中,我们通过分子生物学方法,在尖孢镰刀菌的基础上,进行致病基因的敲除,获得与致病菌具有相同生态位的毒力减弱菌株,用于与野生菌竞争。盆栽实验表明其对西瓜连作障碍具有一定的缓解作用,为连作障碍的克服提供了新的技术手段。接着我们将过滤富集FON菌丝进行灭活处理,作为土壤改良剂施加,盆栽实验表明该处理改善了土壤微环境及西瓜生理指标,可以较好的缓解西瓜连作障碍。本研究中,我们选定尖孢镰刀菌中参与毒素转运的FUBT基因,对同源保守区域设计引物,获得目的基因上下游序列,以潮霉素为筛选标记进行融合PCR,最终利用同源重组,制造获得了毒素缺陷型菌株△FUBT(FO-1)。对⊿FUBT的生长和产孢量进行检验,与野生菌株没有显著性差异。缺陷菌株回接结果表明,其仍能侵染定殖西瓜。对缺陷株进行产毒检测,发现缺陷菌株毒素产生减少至26.5μ...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．１融合ＰＣＲ过程及引物（ＰＮＰ６）示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｆｕｓｉｏｎ?ＰＣＲ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｄ?ｐｒｉｍｅｒｓ?（Ｐ１－Ｐ６）??

第２章尖孢镰刀菌毒素缺陷菌株的定向构建??行序列?ＢＬＡＳＴ?比对，发现与?ＦｗｍＷｗｗ?ｒｗｙｐｏｒｗｗ?ＰＨＷ８０８?的?ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｌ．１０８的同源性较高，根据数据库中提供的该基因的上下游序歹ｉｊ??设计引物，获得了目的基因....

图２．２尖孢镰菌目的基因上下游、潮霉素抗性基因和融合序列ＰＣＲ扩增??

种针将长出的真菌菌落挖??出。一周后，计算内生菌的分离率。??２．１．６数据分析??ＰＣＲ产物测序比对分析软件为ＣｌｕｓｔａｌＸ２．１，其他基本数据则用ＳＰＳＳ１３．０??软件Ｏｎｅ－ｗａｙ?ＡＮＯＶＡ中Ｄｕｎｃａｎ’ｓ?ｔｅｓｔ检验方式分析相关数据间的显著性差??异（Ｐ＜０．０....

图２．３尖孢镰刀菌转化子筛选??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｔｒａｎｓｆｏｎｎａｎｔｓ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ??Ａ：浓度１００?ｐｇ／ｍＬ潮霉素ＰＤＡ培养基（尖孢镰刀菌原生质体）；??Ｂ、Ｃ：浓度ｌＯＯｐｇ／ｍＬ潮霉素ＰＤＡ培养基（原生质体转化的尖孢镰刀菌）；??

第２章尖孢镰刀菌毒素缺陷菌株的定向构建??２．２．２转化子筛选??经过原生质体的转化，在含有潮霉素的再生培养基上进行筛选培养５ｄ后出??现菌落（如图２．３），接着将拟转化子转接到含有ｌＯＯ＾ｇ／ｍＬ潮霉素的ＰＤＡ培养??基上继续传代５次后，仍继续生长的确定为具有稳定的潮霉素抗性的....

图２．４转化子ＰＣＲ验证??Ｆｉｕｒｅ?２．４?Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ＰＣＲ?ａｍｌｉｃａｏｎ??

第２章尖孢镰刀菌毒素缺陷菌株的定向构建??列一致，说明潮霉素抗性基因已通过同源重组将目的基因缺失，确认拟转化子??为阳性转化子Ｆ０－１。??突变株?野生株??Ｍ?Ｍｕｔａｎｔ??＾＾ｐ？＿Ｆｕｂｌ＿ＦＲ??图２．４转化子ＰＣＲ验证??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ....

本文编号：3970896