基于核酸扩增技术的柑橘黄龙病检测方法研究

发布时间：2024-12-03 20:20

　　柑橘黄龙病(Citrushuanglongbing,HLB)是世界范围内最具毁灭性的柑橘病害之一,给柑橘产业造成巨大经济损失,实现其现场快速检测具有重要意义。本课题以HLB最主要的病原菌Las(Candidatus Liberibacter asiaticus)为研究对象,着眼于其在现场检测中存在的问题,以核酸扩增技术为基础,对核酸提取、核酸扩增、扩增产物检测这三个模块的快速化、简洁化地完成进行研究,探索新型、简便、快速的Las现场检测方法。本论文的主要研究内容及结论如下:(1)建立了 Las实时荧光PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法。设计3组Las PCR引物并筛选出扩增效果最优的引物对,通过退火温度的调节解决PCR的非特异性扩增问题,最后评估了该体系的检测灵敏度,其灵敏度与目前较常用的OI1/OI2cPCR方法相当。综上,所建立的Las实时荧光PCR检测方法可代替OI1/OI2c PCR,用于Las的日常检测。(2)建立了 基于环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的Las现场可视化检...

【文章页数】：94 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
符号清单
1 绪论
    1.1 柑橘黄龙病概况
        1.1.1 柑橘黄龙病的发生情况及分布
        1.1.2 柑橘黄龙病症状和危害
            1.1.2.1 柑橘黄龙病症状
            1.1.2.2 柑橘黄龙病危害
        1.1.3 柑橘黄龙病检测技术
            1.1.3.1 传统生物学诊断
            1.1.3.2 电镜观察
            1.1.3.3 血清学检测
            1.1.3.4 分子生物学检测
    1.2 基于核酸扩增技术的检测方法基本流程及其存在的问题
        1.2.1 核酸提取
        1.2.2 核酸扩增
        1.2.3 扩增产物检测
        1.2.4 本节小结
    1.3 核酸扩增技术原理及在柑橘黄龙病检测中的应用
        1.3.1 聚合酶链式反应(PCR)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用
            1.3.1.1 PCR原理
            1.3.1.2 PCR在柑橘黄龙病检测中的应用现状
        1.3.2 环介导恒温扩增(LAMP)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用
            1.3.2.1 LAMP原理
            1.3.2.3 LAMP在柑橘黄龙病检测中的应用现状
        1.3.3 重组酶聚合酶扩增(RPA)原理及其在柑橘黄龙病检测中的应用
            1.3.3.1 RPA原理
            1.3.3.2 RPA在柑橘黄龙病检测中的应用现状
        1.3.4 本节小结
    1.4 研究目的、内容和技术路线
        1.4.1 研究目的和内容
        1.4.2 技术路线
    1.5 本章小结
2 Las实时荧光PCR检测方法的建立
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 材料和试剂
            2.2.1.1 植物材料
            2.2.1.2 常用试剂
        2.2.2 仪器设备
        2.2.3 实验方法
            2.2.3.1 柑橘叶片核酸提取
            2.2.3.2 实时荧光PCR引物设计与体系建立
            2.2.3.3 OI1/OI2c PCR扩增
            2.2.3.4 灵敏度评估
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 实时荧光PCR引物设计与体系建立
        2.3.2 灵敏度评估
    2.4 本章小结
3 基于LAMP的Las现场可视化检测方法的建立
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 材料和试剂
            3.2.1.1 植物材料
            3.2.1.2 常用试剂
        3.2.2 仪器设备
        3.2.3 实验方法
            3.2.3.1 柑橘叶片核酸快速提取
            3.2.3.2 LAMP引物设计和反应体系建立
            3.2.3.3 TaqMan PCR
            3.2.3.4 LAMP扩增产物可视化检测
            3.2.3.5 灵敏度评估
            3.2.3.6 实际样本检测
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 LAMP引物设计和体系建立
        3.3.2 柑橘叶片核酸快速提取
        3.3.3 LAMP产物可视化检测
        3.3.4 基于LAMP的Las现场可视化检测方法灵敏度评估
        3.3.5 实际样本检测
    3.4 本章小结
4 基于RPA的Las现场快速可视化检测方法的建立
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 材料和试剂
            4.2.1.1 植物材料
            4.2.1.2 常用试剂
        4.2.2 仪器设备
        4.2.3 实验方法
            4.2.3.1 NaOH法快速提取柑橘叶片DNA
            4.2.3.2 RPA引物设计及反应体系建立
            4.2.3.3 实时荧光PCR
            4.2.3.4 RPA扩增产物可视化检测
            4.2.3.5 基于RPA的Las现场快速可视化检测法灵敏度评估
            4.2.3.6 实际样本检测
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 RPA引物设计和反应体系建立
        4.3.2 NaOH法快速提取柑橘叶片DNA
        4.3.3 RPA扩增产物可视化检测
        4.3.4 基于RPA的Las现场快速可视化检测方法灵敏度评估
        4.3.5 实际样本检测
    4.4 本章小结
第五章 总结与展望
    5.1 主要研究结论
    5.2 主要特色及创新点
    5.3 进一步研究展望
参考文献
个人简介



本文编号：4014084