百合斑驳病毒dsRNA介导的抗病性研究
发布时间：2024-12-22 07:52
原核表达病毒病原dsRNA的抗病毒策略与植物抗病毒基因工程相比更加安全、便捷,且比体外合成dsRNA省时省力。百合受百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)侵染严重,目前防治措施还是以传统脱毒和化学处理为主,作为单子叶植物很难利用当前转基因技术得到抗性百合。本研究首次利用原核表达系统得到了源于LMoV外壳蛋白(CP)和柱状内含体蛋白(CI)基因的dsRNA,并证明此方法在抗百合斑驳病毒上的可行性。本研究分别选取LMo V CP和CI的基因热点序列,通过OZ-LIC(One-step,zero-background ligation-independent cloning)法将目的基因的正反片段分别插入到植物表达载体pRNAi-LIC内含子的两侧,成功构建了含有CI-517 bp,CI-295 bp和CP-400 bp三种发卡结构的RNAi载体。借助农杆菌渗入法介导的瞬时表达系统在烟草上进行抗病毒分析,RT-PCR和间接ELISA结果显示源于CI-517 bp和CI-295 bp的反向重复片段转录出的发卡RNA(hpRNA)对入侵病毒有较好的干扰作用,而CP-400 b...
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 百合斑驳病毒(LMoV)研究进展
1.1.1 LMoV概述
1.1.2 LMoV的基因组学
1.1.3 LMoV侵染对百合的生理病理影响
1.1.4 LMoV的检测
1.1.5 LMoV的常规防治
1.2 RNAi技术
1.2.1 RNAi的发现
1.2.2 RNAi的作用机制
1.3 RNA沉默防治植物病毒的研究进展
1.3.1 植物抗病毒基因工程的发展
1.3.2 病毒对植物RNA沉默的抑制
1.4 原核表达dsRNA进行植物抗病毒的研究进展
1.5 本研究的目的、意义和内容
2 ihpRNA干扰载体的构建
2.1 实验材料和试剂
2.2 实验方法
2.2.1 感病百合叶片总RNA的提取
2.2.2 LMoV CI基因的获得
2.2.3 重组质粒pMDTM18-CI的获得
2.2.4 CI517、CI295、CP400正反片段的获得
2.2.5 OZ-LIC法构建ihpRNA干扰载体
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒pMDTM18-CI的获得
2.3.2 CI517、CI295、CP400正反片段的获得
2.3.3 ihpRNA干扰载体的获得
2.4 讨论
2.5 小结
3 瞬时表达检测ihpRNA干扰载体的抗性
3.1 实验材料和试剂
3.2 实验方法
3.2.1 农杆菌工程菌的获得
3.2.2 农杆菌渗入法介导的瞬时表达
3.2.3 瞬时干扰作用的抗性检测
3.3 结果与分析
3.3.1 农杆菌工程菌的获得
3.3.2 瞬时干扰作用的抗性效果
3.4 讨论
3.5 小结
4 原核表达LMoV编码基因同源dsRNA的研究
4.1 实验材料和试剂
4.2 实验方法
4.2.1 LMoV-dsRNA表达载体的构建
4.2.2 LMoV-dsRNA原核表达工程菌的构建
4.2.3 LMoV-dsRNA的诱导表达
4.2.4 LMoV-dsRNA的鉴定
4.2.5 LMoV-dsRNA的诱导条件优化
4.3 结果与分析
4.3.1 LMoV-dsRNA表达载体的构建
4.3.2 LMoV-dsRNA原核表达工程菌的构建
4.3.3 LMoV-dsRNA的诱导表达
4.3.4 LMoV-dsRNA的诱导条件优化
4.4 讨论
4.5 小结
5 LMoV-dsRNA的抗病性鉴定
5.1 实验材料和试剂
5.2 实验方法
5.2.1 高压破碎法制备dsRNA粗制品
5.2.2 异丙醇沉淀法提取dsRNA
5.2.3 dsRNA粗制品的稳定性检测
5.2.4 dsRNA的抗病分析
5.3 结果与分析
5.3.1 LMoV-dsRNA的稳定性检测结果
5.3.2 百合的发病情况
5.3.3 RT-PCR检测
5.3.4 实时定量分析
5.4 讨论
5.5 小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 有待进一步开展的工作
参考文献
附录A 常用培养基、缓冲液及抗生素配方
附录B 实验所用仪器
附录C 实验所用质粒图谱及基因序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：4019686
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 百合斑驳病毒(LMoV)研究进展
1.1.1 LMoV概述
1.1.2 LMoV的基因组学
1.1.3 LMoV侵染对百合的生理病理影响
1.1.4 LMoV的检测
1.1.5 LMoV的常规防治
1.2 RNAi技术
1.2.1 RNAi的发现
1.2.2 RNAi的作用机制
1.3 RNA沉默防治植物病毒的研究进展
1.3.1 植物抗病毒基因工程的发展
1.3.2 病毒对植物RNA沉默的抑制
1.4 原核表达dsRNA进行植物抗病毒的研究进展
1.5 本研究的目的、意义和内容
2 ihpRNA干扰载体的构建
2.1 实验材料和试剂
2.2 实验方法
2.2.1 感病百合叶片总RNA的提取
2.2.2 LMoV CI基因的获得
2.2.3 重组质粒pMDTM18-CI的获得
2.2.4 CI517、CI295、CP400正反片段的获得
2.2.5 OZ-LIC法构建ihpRNA干扰载体
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒pMDTM18-CI的获得
2.3.2 CI517、CI295、CP400正反片段的获得
2.3.3 ihpRNA干扰载体的获得
2.4 讨论
2.5 小结
3 瞬时表达检测ihpRNA干扰载体的抗性
3.1 实验材料和试剂
3.2 实验方法
3.2.1 农杆菌工程菌的获得
3.2.2 农杆菌渗入法介导的瞬时表达
3.2.3 瞬时干扰作用的抗性检测
3.3 结果与分析
3.3.1 农杆菌工程菌的获得
3.3.2 瞬时干扰作用的抗性效果
3.4 讨论
3.5 小结
4 原核表达LMoV编码基因同源dsRNA的研究
4.1 实验材料和试剂
4.2 实验方法
4.2.1 LMoV-dsRNA表达载体的构建
4.2.2 LMoV-dsRNA原核表达工程菌的构建
4.2.3 LMoV-dsRNA的诱导表达
4.2.4 LMoV-dsRNA的鉴定
4.2.5 LMoV-dsRNA的诱导条件优化
4.3 结果与分析
4.3.1 LMoV-dsRNA表达载体的构建
4.3.2 LMoV-dsRNA原核表达工程菌的构建
4.3.3 LMoV-dsRNA的诱导表达
4.3.4 LMoV-dsRNA的诱导条件优化
4.4 讨论
4.5 小结
5 LMoV-dsRNA的抗病性鉴定
5.1 实验材料和试剂
5.2 实验方法
5.2.1 高压破碎法制备dsRNA粗制品
5.2.2 异丙醇沉淀法提取dsRNA
5.2.3 dsRNA粗制品的稳定性检测
5.2.4 dsRNA的抗病分析
5.3 结果与分析
5.3.1 LMoV-dsRNA的稳定性检测结果
5.3.2 百合的发病情况
5.3.3 RT-PCR检测
5.3.4 实时定量分析
5.4 讨论
5.5 小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 有待进一步开展的工作
参考文献
附录A 常用培养基、缓冲液及抗生素配方
附录B 实验所用仪器
附录C 实验所用质粒图谱及基因序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：4019686
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