利用分子标记技术辅助选育抗寒铁皮石斛

发布时间：2020-03-30 17:08

【摘要】：铁皮石斛为石斛属植物,以茎入药。由于目前铁皮石斛相互引种,种源混乱,严重影响其品质稳定性,加上其喜温暖湿润气候,不耐寒,有必要对其进行种质资源评价及良种辅助筛选。本文收集了福建厦门、泰宁、邵武和云南、浙江等地区共33份铁皮石斛栽培种和13份野生种,利用CDDP、SCoT、TRAP、CoRAP分子标记技术对铁皮石斛进行遗传多样性分析,并利用抗寒相关基因辅助筛选抗寒铁皮石斛,结果如下:1、利用分子标记技术分析铁皮石斛遗传多样性16条CDDP引物,共扩增出151条带,多态性条带占总条带95.3%,PIC平均0.815,RP平均1.653;14条SCoT引物共扩增出92条带,多态性条带占比93.9%;21对TRAP引物共扩增出278条带,多态性条带占比99.03%,PIC平均0.899,RP平均2.054;16对CoRAP引物共扩增出208条带,多态性条带占比93.2%,PIC平均0.880,RP平均1.806,四种分子标记扩增结果表明试供铁皮石斛遗传背景丰富,有较高的遗传多样性。另外,针对铁皮石斛抗寒基因开发的TRAP、CoRAP标记分析中,野生种遗传多样性高于栽培种,表明在复杂多变的自然环境下,野生种抗性相关基因存在更大遗传变异。遗传参数上,CDDP标记居群PPL平均为74.61%,居群H平均0.1992,居群I平均0.3128,居群间Gst为0.1778,居群间Nm为2.3118,;SCoT标记中,PPL平均78.36%,H平均0.2310,I平均0.3552,Gst 0.265,Nm 1.387;TRAP标记中,PPL平均82.85%,H平均0.2716,I平均0.4105,Gst 0.2017,Nm 1.9793;CoRAP标记中,PPL平均79.80%,H平均0.2045,I平均0.3259,Gst 0.1808,Nm 2.2656。四种标记遗传参数表明铁皮石斛遗传变异主要发生在居群内,居群间有一定的基因交流。聚类分析中,CDDP标记在0.668时将铁皮石斛分为2大类,但不同地区栽培种界限不明显,相互重叠。野生种在相似性系数0.732时与栽培种分离,SCoT、TRAP、CoRAP标记分别在0.59、0.536、0.61时将铁皮石斛栽培种和野生种分离,不同地区的栽培种无法分离,主坐标分析中显示地理因素与不同地区铁皮石斛没有明显的相关性,对于野生种和栽培种,四种分子标记均能将其明显分离,其中TRAPSCoTCoRAPCDDP。2、利用分子标记技术辅助筛选抗寒铁皮石斛在CDDP标记中,利用锚定WRKY、MYB、ERF抗逆相关转录因子引物共同筛选出9份具有抗逆性的铁皮石斛优良种质;在SCoT标记中,利用在抗寒铁皮石斛中产生差异条带的SCoT-8、SCoT-59、11(li)引物筛选出5份具有抗寒性的铁皮石斛优良种质;在TRAP标记中,利用锚定CBF1、DREB1、CDPK1冷响应相关基因引物筛选出11份具有抗寒性的铁皮石斛优良种质;在CoRAP标记中,利用锚定冷响应基因COR15a、KIN1、GsLRPK引物筛选出13份具有抗寒性的铁皮石斛优良种质;在STS标记中,利用锚定DREB1、GsLRPK、KIN1基因的特异引物筛选出9份具有抗寒性的铁皮石斛优良种质;最后将CDDP、SCoT、TRAP、CoRAP、STS标记筛选的抗寒铁皮石斛综合筛选,最终筛出3份抗寒铁皮石斛种质,编号10、44、13。3、铁皮石斛低温胁迫中相关基因和生理变化研究及品质测定低温胁迫筛选的抗寒铁皮石斛,其热激蛋白HSP70、蛋白激酶LRPK、冷诱导KIN1、多糖合成DoPMM、转录因子DREB1基因大量表达,其中HSP70基因和冷诱导KIN1基因在胁迫处理期内,表达量持续上升,处理期间未见减少;DREB1转录因子和LRPK蛋白激酶基因在处理期间先显著增加后逐渐降低,但仍高于对照表达量;多糖合成关键基因DoPMM在低温处理期内同样先增加后降低,至解除胁迫时仍高于对照表达量。低温处理下,耐寒铁皮石斛可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、SOD酶活在处理期间均呈现显著增加并持续积累;丙二醛含量呈现波动现象,至处理结束时整体变化不显著;电导率随着时间的延长均出现显著增大趋势;不耐寒种在低温胁迫下可溶性蛋白、可溶性糖显著增加但含量低于耐寒种,且在处理后期出现游离脯氨酸、SOD酶活下降趋势,丙二醛含量及电导率显著增加趋势;叶绿素含量则所有种质均出现显著下降趋势,不耐寒种下降速率大于耐寒种。品质测定中,10、44、13号铁皮石斛多糖含量分别为32.80%,38.60%,28.30%,大于中国药典规定最低含量;石斛碱含量分别为0.0307%,0.0315%,0.0360%;柚皮素含量分别为0.156 mg/g,0.187 mg/g,0.133 mg/g,品质与抗寒能力综合隶属函数分析134410。
【图文】：

图 2.1 铁皮石斛 CDDP 标记正交设计扩增结果Fig.2.1 D. candidum CDDP marker orthogonal design amplification results综合梯度退火实验及单因素优化实验（部分实验见图 2.2、2.3），最终确定20 μL 体系，其中，DNA 模板 30 ng、引物 0.5 μmol/L、聚合酶 1.5 U、dNTPs0.2 mmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L，并进行体系验证（图 2.4）。应用优化体系，，以样品 DNA 为模板，对 Collard 和 Mackill 发表的 21 条引物进行筛选，选择多态性好，条带清晰可辨的引物 16 条（表 2.6），利用 16 条引物对 46 份样本进行扩增。

图 2.1 铁皮石斛 CDDP 标记正交设计扩增结果Fig.2.1 D. candidum CDDP marker orthogonal design amplification resul综合梯度退火实验及单因素优化实验（部分实验见图 2.2、2.3），最20 μL 体系，其中，DNA 模板 30 ng、引物 0.5 μmol/L、聚合酶 1.5 U、0.2 mmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L，并进行体系验证（图 2.4）。应用优化以样品 DNA 为模板，对 Collard 和 Mackill 发表的 21 条引物进行筛选，态性好，条带清晰可辨的引物 16 条（表 2.6），利用 16 条引物对 46 份行扩增。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.239

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本文编号：2607813