淹水胁迫下小麦胚乳线粒体损伤和细胞色素c释放对细胞程序性死亡的影响

发布时间：2020-04-05 05:39

【摘要】：实验室前期研究表明,小麦(Triticum aestivum L.)胚乳发育需经历细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)过程,淹水可加速其进程。为进一步揭示淹水胁迫下小麦胚乳细胞PCD进程提前的生理和细胞学机制,本实验以华麦8号为材料,在开花当天对其进行淹水处理,从显微和超微结构水平研究了胚乳细胞中线粒体动态变化;采用免疫荧光、蛋白印迹等技术多角度研究了胚乳中细胞色素c释放情况;利用实时定量PCR研究了胚乳中线粒体渗透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)组分相关基因的表达情况。另外,研究了抗环血酸、环孢菌素A和过氧化氢处理对耐湿品种华麦8号和不耐湿品种华麦9号生理生化和PCD进程的影响。研究结果表明:1.未淹水情况下,胚乳细胞超微结构显示,发育早期胚乳中线粒体结构完整,内嵴清晰,花后12 d线粒体轻微变形,内嵴模糊,花后20 d大部分线粒体降解,仅在细胞边缘处存在少量线粒体,结构模糊。线粒体膜电位和膜吸光度检测结果显示,随着胚乳细胞发育时间的延长线粒体膜电位膜降低,膜通透性增大,线粒体损伤加剧。淹水处理后,花后10 d胚乳细胞中部分线粒体明显膨大,花后15 d胚乳细胞中大部分线粒体内部出现电子透明区域,有被膜结构包裹的未降解完全的线粒体存在;线粒体膜电位和膜吸光度低于同时期未淹水处理组。正常生长的小麦胚乳细胞中线粒体结构随着胚乳PCD的进行逐渐被破坏,淹水胁迫导致这种损伤加剧,时间提前。2.未淹水情况下,免疫荧光结果显示,在花后10 d之前胚乳细胞中细胞色素c主要定位于线粒体上,花后12 d细胞色素c开始从线粒体释放到胞质中,花后15 d和花后20 d细胞色素c进一步释放;超微细胞化学定位发现,花后8 d细胞色素c主要集中在线粒体上,花后15 d在线粒体内外均可检测到细胞色素c的存在;蛋白印迹结果同样显示,花后12 d以后随着胚乳细胞发育胞质中细胞色素c含量逐渐增多。淹水胁迫下,免疫荧光和蛋白印迹结果都显示,在花后10 d即可观察到细胞色素c从线粒体释放到胞质中,并且释放的细胞色素c含量高于同时期未淹水处理组。正常生长的小麦胚乳细胞中细胞色素c在花后12 d开始从线粒体释放到胞质中,而淹水胁迫下细胞色素c在花后10 d即开始从线粒体释放,且释放量大于同时期未淹水处理组。淹水胁迫导致细胞色素c释放时间提前,释放量增加。3.实时定量PCR结果显示,未淹水情况下,小麦胚乳细胞中VDAC2表达量基本不变、VDAC3表达量先增加后降低、ANT1表达量逐渐降低,与蛋白折叠相关基因HSP70和HSP90表达量均先降低后增加。而淹水处理后VDAC2和VDAC3表达量均在花后8 d显著增加,ANT1表达量在花后10 d达到峰,HSP70和HSP90基因表达量均低于未淹水对照组。MPTP可能参与淹水胁迫促进胚乳细胞PCD过程的调节,而蛋白折叠障碍可能在其中承担一部分作用。4.使用外源H_2O_2处理后,与未进行药物处理对照组相比,华麦8号胚乳细胞中H_2O_2和O~(2-)含量上升,SOD和CAT活性增加,线粒体膜透性增加,细胞色素c释放增多,caspase-like蛋白酶活性上升;华麦9号中变化趋势类似,但与华麦8号相比较,细胞中O~(2-)积累更多、CAT活性上升幅度较小。使用外源抗环血酸处理后,华麦8号和华麦9号中H_2O_2含量均降低。使用外源环孢菌素A处理后,部分抑制了H_2O_2处理导致的ROS含量上升、线粒体膜透性增加、细胞色素c释放增多和caspase-like蛋白酶活性上升等现象。以上结果说明,外源H_2O_2处理加剧了小麦胚乳细胞PCD,且华麦9号在遭遇外界胁迫后胚乳中ROS积累更多,抗氧化酶系统较弱,可能是其不耐湿的机制之一。综上所述,淹水处理加剧小麦胚乳细胞中线粒体损伤和细胞色素c释放,可能是淹水导致胚乳细胞PCD加剧和进程提前的原因之一。线粒体在正常生长和淹水胁迫下小麦胚乳细胞PCD的调控过程中发挥重要作用。华麦9号胚乳中ROS累积多以及抗氧化系统弱,可能是其不耐湿的原因之一。
【图文】：

细胞程序性死亡,信号转导途径

图 1 细胞程序性死亡主要信号转导途径（Gupta et al 2006）Fig.1 The major signal transduction pathways for programmed cell death（Gupta et al 2006）1.4.1 死亡受体途径细胞表面的死亡受体（Death receptor）家族包括 8 种，它们共同的特点是具相似的、富含半胱氨酸的细胞外结构域和胞内死亡区域（Death domain）（Ashkenaand Dixit 1998）。外界信号因子通过与相关配体结合使其发生寡聚化及结构的改变暴露出能与衔接蛋白结合的胞内死亡区域，聚集并激活衔接蛋白（caspase8 等）引发下游 caspases 的活化并最终导致细胞凋亡的发生（Ashkanazi and Dixi 1998）另外，激活的 caspase8 可以催化 Bid 的切割（Bcl-2 家族的促凋亡分子），作用于粒体外膜，在其他相关的 Bcl-2 家族成员的参与下诱导线粒体外膜通透性增加，，而促进细胞色素 c 的释放，最终导致细胞死亡（Kantari and Walczak 2011）。

淹水胁迫,淹水处理,胚乳,正常条件

3.1 淹水胁迫对小麦胚乳细胞 PCD 进程的影响不同发育时期的未淹水处理和淹水处理的小麦胚乳 Evans Blue 染色结果（图 2），随着胚乳细胞的发育，染色反应加深。8 DAF，在未淹水处理（对照淹水处理的小麦胚乳中都未观察到被染色的死亡胚乳细胞，且对照较淹水处理麦籽粒更饱满（图 2A1, B1）。10 DAF，在未淹水处理和淹水处理的小麦胚乳未观察到明显染色反应（图 2 A2, B2）。12 DAF，未淹水处理的小麦胚乳中才出现少量染成蓝色的死亡细胞（图 2A3），而淹水处理组中有较多染成深蓝色亡细胞（图 2 B3）。15 DAF，未淹水处理的胚乳中可观察到明显的蓝色，有更乳细胞死亡（图 2A4），而淹水处理组中染色加深，染色细胞数量增加（图 2 上述结果说明，未淹水处理的小麦胚乳经历了一个 PCD 过程，淹水胁迫导致胚胞程序性死亡进程提早，死亡数量较对照增加。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

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