玉米产量性状相关基因Emp10及ter1的定位与克隆

发布时间：2020-04-25 17:17

【摘要】：粒重和穗粒数是玉米单穗产量最重要的影响因子,而籽粒和花序的发育是影响粒重和穗粒数的关键因素,因此,克隆玉米籽粒及花序发育相关的关键QTL/基因,解析其功能及调控机制具有重要的理论和应用意义。本研究通过图位克隆的方法,克隆了一个影响玉米籽粒发育的基因,命名为Empty pericarp10(Emp10),并阐明了其影响籽粒发育的分子机制;同时利用大刍草在现代玉米自交系中的导入系,精细定位了一个来源于大刍草的影响玉米穗行数的主效QTL,命名为teosinte ear rank1(ter1),。获得的主要研究结果如下:1、emp10突变体表型分析。emp10突变体籽粒胚和胚乳发育停滞,成熟后籽粒空瘪,胚致死无法发芽。细胞学观察发现,与野生型相比,突变体的胚停滞在原胚体时期,胚乳中淀粉积累显著减少,基部转运层细胞的细胞壁没有向内生长。2、Emp10的定位克隆。遗传分析发现emp10籽粒空瘪性状受单个隐性核基因控制,利用B73与emp10突变体杂交构建的6912个F_2个体,将Emp10定位至64.5kb区间内。根据候选基因的序列及差异表达分析,确定5’UTR和exon1丢失了431bp且在emp10中几乎不表达的候选基因GM16即为Emp10。Emp10编码含有10个PPR基序的P型PPR蛋白。进化分析表明,EMP10在高粱中的同源基因为Sobic.001g092300。3、Emp10的表达与定位。表达谱分析表明,Emp10属于组成型表达基因,在雌穗和籽粒中的表达较高。亚细胞定位结果表明,EMP10特异地靶向线粒体。4、Emp10的作用机理。通过分析线粒体基因的转录本,检测到在emp10中线粒体电子传递链复合体I的重要亚基nad2 intron1没有被剪切。BN-PAGE结果显示,复合体I在emp10中不能正常组装,NADH脱氢酶染色结果显示emp10中复合体I活性几乎完全丧失。透射电镜结果显示emp10中线粒体出现嵴断裂降解,即线粒体结构遭到严重破坏。与此同时,交替氧化酶途径的重要基因AOX2和AOX3在emp10中被显著诱导上调表达。上述所有结果表明,Emp10功能缺失,导致线粒体电子传递链的氧化磷酸化途径受损,受精后的籽粒发育所需能量不能正常供应,导致种子发育迟缓并出现空皮籽粒。5、ter1精细定位。从大刍草与玉米自交系Zong3的BC_2F_7群体中分离出的有柄小穗退化、穗行数减少的材料Ter1,Ter1表现出部分显性,将Ter1与玉米自交系C01杂交,构建了包含3822个单株的F_2分离群体,从中筛选到16个重组类型,通过子代测验、纯合重组系与纯合非重组系试验验证,将ter1定位于标记C4-M4之间约300 kb范围内。6、大刍草BAC库筛选与测序分析。通过菌液PCR的方法从70656个BAC克隆中筛选到10个部分包含目标片段的阳性克隆,选取a0085P23/a0131J09克隆进行三代测序。测序结果显示该区间在大刍草中只有约250 kb,与玉米参考基因组的差异主要集中在基因间区。候选区间在大刍草与玉米自交系B73中均包含2个候选基因Zm674和Zm675。7、ter1候选基因的结构及表达分析。Zm674和Zm675均编码跨膜蛋白,分别含有Tmemb_185A,RhaT跨膜结构域,ZM674在C末端包含有C3HC4 Zinc finger结构域。表达分析表明Zm674表达无差异,Zm675在Ter1中上调表达。8、ter1关键候选基因的鉴定。针对Zm674和Zm675两个候选基因设计特异引物,在Zong3和Ter1之间测序分析,分析结果表明,Zm674编码区只有一个SNP差异,并不改变编码的氨基酸,而Zm675编码区存在6个SNPs差异,导致5个氨基酸发生改变,其中第644位的SNP在大刍草与玉米中已基本固定。88.6%(163/181)的大刍草材料为A,97.3%(496/510)的玉米材料为G。9、载体构建与遗传转化。分别构建了Zm674和Zm675的CRISPR-Cas9基因编辑载体并进行遗传转化。
【图文】：

大刍草,玉米植株,植株,差别

玉米产量性状相关基因 Emp10 及 ter1 的定位与克隆第一章前言玉米的起源及重要性状的驯化选择研究进展玉米(Zea mays L.ssp.mays) 是世界范围内种植最广的作物，约 9000中南部巴尔萨斯河流域的原住民对当地的野生近缘种：类蜀黍/大刍 Parviglumis) 进行驯化选择而来(Piperno and Flannery 2001, Matsuok草与玉米的差异主要体现在株型（图 1.1）与穗部性状上（图 1.2），个方面：（1）两行 vs 四行甚至更多；（2）单个小穗 vs 成对小穗；（s 柔软；（4）落粒 vs 不落粒；（5）初级侧花序为雄花序 vs 雌花序；（为长分支 vs 短分支(Doebley et al 1990)。

玉米雌穗,大刍草,穗轴,顶端

图 1.2 大刍草与玉米雌穗上的差异的穗轴暴露在顶端。B, 大刍草雌穗穗轴节间和颖壳(Wan2 The ear phenotype differences between teosinte b (cb) exposed at top. B, Teosinte ear with the rachis interno过构建玉米-大刍草分离群体，利用连锁分位到玉米基因组不同的位置(Doebley et 状受多个遗传因子影响，如有柄小穗(PS, P则由主效基因及多个修饰因子决定，，如研工作者不懈努力，影响大刍草与玉米表型制分支和侧支花序性别的 tb1 (Doebley et (Wills et al 2013)、控制颖壳由坚硬变短变柔期的 ZmCCT (Yang et al 2013) 等。通过同三个基因 Zmsh1-1、Zmsh1-5.1 和 Zmsh1
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S513

【参考文献】