植酸酶phyA基因在蛹虫草菌丝体中的表达及功能研究

发布时间：2020-04-27 07:57

【摘要】：植酸是磷的主要储存形式,它作为一种抗营养因子,是阻碍植物吸收矿物质和降低动物饲料磷利用率的最主要因素。植酸酶的研究和开发可以有效解决这一问题。目前,人们多利用细菌、真菌和植物等表达系统重组并生产植酸酶,并且应用广泛。但仍旧需要更加绿色、优质和高效的植酸酶表达系统。蛹虫草作为一种食用药用真菌,其成分具有调节免疫功能以及抗炎等药用活性,具备生长周期短,安全性好等优点,因此被认为是重组表达植酸酶的良好受体材料,但目前尚未报道利用蛹虫草作为表达载体重组植酸酶。本试验利用蛹虫草作为表达载体,将含有植酸酶phyA基因真菌表达载体pCB130NG转入到蛹虫草菌株中,通过测定蛹虫草重组表达植酸酶的表达量和酶活情况。再获得产植酸酶蛹虫草菌株的同时,大量发酵进行接下来肉鸡饲料添加实验。实验选择了1日龄AA肉鸡144只,随机分为6个处理组,每个处理3个重复,每个重复有8只肉鸡。处理组T0为正常日粮组,处理组T1为正常日粮添加野生型蛹虫草,处理组T2为正常日粮添加市售植酸酶500 U/kg,处理组T3-T5为正常日粮添加产植酸酶蛹虫草,添加水平分别为250 U/kg、500 U/kg和1000 U/kg。试验日期为42天,分前期1-21日龄和后期22-42日龄。分别探究了产植酸酶蛹虫草对肉鸡的生长性能、胫骨发育、营养物质利用率以及免疫器官指数的影响,具体研究结果如下:1.本试验利用重组质粒pCB130NG-phyA转入蛹虫草原生质体中,通过PCR检测以及Western Blot检测得到了转phyA基因的蛹虫草菌株,ELISA测定phyA基因重组蛋白表达量最高约占总可溶蛋白的0.91±0.064‰,利用钼钒酸铵比色法测定每克产植酸酶蛹虫草菌株冻干粉中植酸酶酶活为402.2 U。2.在肉鸡生长性能方面,在1-21日龄和22-42日龄处理组T2、T4和T5三组可显著提升肉鸡平均体重(P0.05),同时处理组T2、T4和T5三组在平均日增重和平均日采食量方面均有显著提高(P0.05)。在1-42日龄时,处理组T2、T4和T5三组肉鸡的料重比与对照组差异显著(P0.05)。3.在胫骨指标方面,在21日龄和42日龄时处理组T2、T4和T5三组相比于对照组胫骨灰分含量具有明显提升(P0.05),同样对胫骨中磷含量水平有明显提高(P0.05)。在21日龄时,处理组T2、T4和T5三组处理组对肉鸡胫骨中钙含量有明显提升(P0.05),在42日龄时处理组T5结果表示明显提升肉鸡胫骨中钙含量(P0.05)。4.在营养物质利用率方面,在21日龄和42日龄时,添加植酸酶处理组T2、T4和T5三组的粗蛋白利用率较比于对照组T0显著提升(P0.05)。在磷利用率方面,21日龄和42日龄,添加植酸酶的四个处理组T2-T5相比于对照组T0差异显著(P0.05)。在钙利用率方面,21日龄下添加植酸酶的四个处理组T2-T5明显提高肉鸡钙利用率(P0.05),在42日龄下,处理组T2、T4和T5可明显提高钙利用率(P0.05)。5.在免疫器官指数方面,日粮中添加产植酸酶蛹虫草相比于对照组,肉鸡免疫器官指数有增加趋势。
【图文】：

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第三章结果与分析.1 利用蛹虫草表达植酸酶1.1 蛹虫草的遗传转化取三块 1 cm 蛹虫草菌块接种于 PDA 液体培养基中，利用混合酶液溶解细胞壁获草原生质体；利用 PEG 转化法将构建好的含有 phyA 基因的 pCB130NG 质粒转化蛹生质体置于 PDA 再生培养基（潮霉素+卡那霉素为 Hyg650 mg/L+Kan300 mg/L）。长出的单一转化子进行鉴定。具体过程如图 3.1。

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图 3.2 转 pCB130NG-phyA 质粒蛹虫草菌株的 PCR 检测结果M: DL2000 DNA Marker；+:阳性对照；－:阴性对照；1~14:再生蛹虫草菌株Fig 3.2 PCR analysis of transgenic pCB130NG-phA Cordyceps militarisM: DL2000 DNA Marker;+: Positive control；－: Negative control;1~14: Cordyceps militaris regrowth PCR determination基因蛹虫草的 Western Blot 检测了验证 phyA 基因在蛹虫草中的表达情况，以野生型蛹虫草菌株作为阴性R 检测为阳性的菌株进行同时进行 Western Blot 检测，结果如图 3.3 所示蛹虫草菌株在 68 kDa 处有目的条带，相比于理论计算的蛋白条带约 64.是糖基化造成的。而野生型蛹虫草没有检测到目的蛋白片段，结果显示转入到蛹虫草中，，蛹虫草成功表达植酸酶蛋白。用 ELISA 试剂盒测定产植酸酶 phyA 基因蛹虫草菌株的表达量。phyA 基因量最高约占总可溶蛋白的 0.91 ±0.064 ‰，将鉴定的高表达的转基因蛹虫实验。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.3

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