百脉根Lj5NG4和LjbHLH93在根瘤共生关系建立过程中的作用研究

发布时间：2020-04-30 00:01

【摘要】：豆科植物的根瘤共生系统是自然界最主要的生物固氮来源。根瘤菌感知豆科植物产生的黄酮类化合物时分泌结瘤因子被视为共生信号传导过程起始。而百脉根结瘤因子受体NFR1和NFR5是感知结瘤因子的重要节点。豆科植物根瘤形成过程,尤其是早期共生关系建立过程中的信号转导机制的深入解析对于揭示根瘤早期发育中共生和免疫系统的协同调控具有重要意义。目前NFR1下游信号传递机制仍没有得到完全的阐明,因此鉴定与LjNFR1互作的蛋白并揭示其共生信号调控网络是研究的重点。本研究以百脉根结瘤因子受体激酶LjNFR1为诱饵,通过建立百脉根根瘤共生不同时期的酵母膜双杂文库筛选获得了一个与之互作的生长素相关转运蛋白Lj5NG4,并以此为研究对象,分析Lj5NG4在百脉根中共生固氮的功能以及作用机制,主要的研究结果如下:1.利用系统发育树分析不同物种5NG4蛋白,发现Lj5NG4属于nodulin MtN21/EamA-like transporter蛋白家族,受生长素诱导调控,其同源蛋白被证实为生长素转运蛋白。将百脉根中已知的生长素转运蛋白与Lj5NG4共同进行系统发育进化树分析,发现Lj5NG4与已知的转运蛋白家族处于不同的进化分支。2.借助tYFP荧光蛋白信号的显微镜观察证实了Lj5NG4在侵染前期根毛中强烈表达,而在后期根瘤内部不表达,预示Lj5NG4更多的在共生侵染前期发挥功能。3.为进一步证实百脉根中Lj5NG4蛋白与LjNFR1蛋白相互作用的存在,利用酵母双杂交以及烟草体内异源系统进行验证,均表明存在互作。4.利用CRISPR/Cas9对Lj5NG4进行基因敲除,通过百脉根稳定转化,经过两代筛选得到T2代纯合稳定突变株。其共生表型统计结果表明Lj5NG4在共生固氮前期抑制侵染线的形成,对前期侵染进行负调控,但对后期结瘤没有显著影响。互补实验进一步证实该结果。5.鉴于Lj5NG4可能是生长素转运子,通过外源施加不同浓度生长素进一步确认生长素能否对突变体表型产生影响。发现低浓度(10-7、10-8、10-9 M)的生长素会减弱Lj5NG4突变后侵染线增加的表型,对共生侵染和根瘤发育发挥正调控功能。大豆皂苷对于调控大豆性状品质有重要意义,在皂苷合成途径中B-香树脂醇合成酶(AMS)是关键的限速酶,研究意义非常重要。金华南老师课题组将大豆AMS的启动子作为诱饵进行酵母单杂筛选,得到大豆Glyma04G、Glyma06G,属于bHLH蛋白家族。由于大豆基因组存在基因倍增,给研究带来很多不便,将其同源基因Lj1g3v2098310.1放在模式植物百脉根中进行研究,并将其命名为LjbHLH93,以此为研究对象,初步探究该基因对共生结瘤带来的影响,主要的研究结果如下:1.借助tYFP荧光蛋白信号的显微镜观察证实LjbHLH93在幼嫩的根瘤中不表达,而在后期根瘤内部的侵染细胞中有强烈的表达,这预示着LjbHLH93可能更多的通过调控成熟根瘤侵染细胞从而影响结瘤。2.通过凝胶阻滞迁移实验未能验证百脉根中LjbHLH93蛋白与LjAMS互作,酵母体内单杂交进行互作验证发现LjAMS在酵母中存在自激活,亦无法验证LjbHLH93与LjAMS相互作用。3.通过CRISPR/Cas9技术对LjbHLH93进行敲除,未能获得稳定转化的突变株,但毛根转化得到的突变株根瘤数目有显著减少。而通过超表达技术未能观察到突变株的共生表型有显著变化。
【图文】：

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官发生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物对结瘤因子的感知可逡逑以引发植物中一系列的分子和生理反应，例如早期共生基因的累积、根毛卷曲和侵逡逑染线（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（图１－２）。细菌可以分裂并向皮质细胞发展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。尽管刚开始根瘤菌的感知发生在表皮，但后期持续的信号传导对于根瘤逡逑菌的侵染和释放的过程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通过宿主衍生的管状隔室发生，具有根毛的表皮细胞弯曲包裹着根逡逑瘤菌向内生长，从而形成侵染线。这种生理变化伴随着根毛极性生长的重新定向，逡逑产生捕获细菌微菌落以形成“侵染区室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）这种牧羊人钩结构逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。从这一点来看，根毛细胞膜内陷并开始向表皮细胞内部伸长，逡逑带动根瘤菌在侵染线内部增殖并往下移动，与此同时，，皮层细胞被重新激活进行有逡逑丝分裂以形成根瘤原基，从而起始根瘤器官发生过程。侵染线向根内部生长到达根逡逑瘤原基

＾逦身邋Ｒｈｉｚｏｂｌｕｍ逡逑图１－１豆科植物与根痛菌相互作用（Ｃｌｕａｅｔａｌ２０１８）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｌｅｇｕｍｅｓ邋ａｎｄ邋ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ逡逑豆科植物形成有效根瘤依赖着两个相互协同的过程：根瘤菌侵染（ｒｈｉｚｏｂｉａ逡逑ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官发生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物对结瘤因子的感知可逡逑以引发植物中一系列的分子和生理反应，例如早期共生基因的累积、根毛卷曲和侵逡逑染线（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（图１－２）。细菌可以分裂并向皮质细胞发展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。尽管刚开始根瘤菌的感知发生在表皮，但后期持续的信号传导对于根瘤逡逑菌的侵染和释放的过程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通过宿主衍生的管状隔室发生，具有根毛的表皮细胞弯曲包裹着根逡逑瘤菌向内生长，从而形成侵染线。这种生理变化伴随着根毛极性生长的重新定向，逡逑产生捕获细菌微菌落以形成“侵染区室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）这种牧羊人钩结构逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。从这一点来看，根毛细胞膜内陷并开始向表皮细胞内部伸长，逡逑带动根瘤菌在侵染线内部增殖并往下移动
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S541.6

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本文编号：2645146