基于转录组测序和小RNA测序的花生不同发育时期油脂和贮藏蛋白合成相关基因的表达研究

发布时间：2020-05-09 11:45

【摘要】：花生富含油脂和贮藏蛋白为我国重要的油料作物和经济作物。花生油脂和贮藏蛋白合成是一个复杂的过程,涉及多种代谢途径、多个关键基因和转录调节因子。本研究通过对4个不同发育时期的花生籽粒进行转录组和小RNA测序,旨在挖掘油脂和贮藏蛋白合成相关的基因,以及参与油脂和贮藏蛋白合成调控的miRNAs,为花生高油脂和高蛋白优良品种的育种提供理论依据。本研究所用材料花生的品种为桂花37,以花后20天(HS_20)、35天(HS_35)、50天(HS_50)和60天(HS_60)的籽粒为材料,分别构建了4个mRNA文库和4个miRNA文库,进行了转录组和小RNA测序。然后对转录组中差异表达的基因和小RNA测序结果中差异表达的基因和miRNA进行分类注释、靶因预测、GO功能注释以及KEGG pathway注释,主要结果如下:(1)通过酸水解法测定四个不同发育时期的花生籽粒油脂含量,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60的油脂含量分别是3.31%、25.89%、45.93%和48.49%。(2)通过构建mRNA文库和转录组测序,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60获得的Total Clean Reads分别是109321068、106867224、109313082和107123540,Q20分别是97.95%、97.88%、97.87%和98.03%。(3)在HS_20-vs-HS_35比较组中,差异表达基因总数是25769个,其中上调差异表达的基因有3235个,下调差异表达的基因有22534个;在HS_35-vs-HS_50比较组中,差异表达基因总数是18403个,其中上调差异表达的基因有11579个,下调差异表达的基因有6824个;在HS_50-vs-HS_60比较组中,差异表达基因总数是12308个,其中上调差异表达的基因有3235个,下调差异表达的基因有9073个。(4)通过分析转录组测序数据,我们筛选到一些与油脂合成相关的持续上调表达的基因,包括1个甘油-3-磷酸酰基转移基因、1个乙酰辅酶A羧化酶基因、2个硬脂酰-ACP去饱和酶基因、1个脂肪酸去饱和酶基因、2个油体相关蛋白基因和7个油脂蛋白基因。(5)从转录组测序数据中筛选到参与油脂合成调节的转录因子和基因有:AP2-EREBP家族转录因子、ABI3VP1家族转录因子、C2C2-Dof转录因子和WD40repeat基因。(6)从转录组测序数据中筛选到2个贮藏蛋白基因,基因id号为107476928和107487873,基因全长分别是1973和2190bp,开放阅读框分别是1803和1887bp,分别编码600和628个氨基酸。花后20天、35天、50天和60天的籽粒中,107476928基因的表达量分别为24.66、753.54、1439.3和1609.72;107487873基因的表达量分别为0.69、73.69、318.99和247.67。另外,还筛选到1个属于致敏原的贮藏蛋白基因Ara h1,基因id号为107466960,基因全长是1949bp,开放阅读框是1764bp,编码587个氨基酸。花后20天、35天、50天和60天的籽粒中的表达量分别为23.89、19053.57、14250.28和19428.49。(7)通过构建miRNA文库和小RNA测序,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60文库获得的Clean tag分别是27054913、26278062、26831657和25659103,Q20分别为99.3%、99.3%、99.2%和99.2%。各样品比对上基因组的small RNA的数目分别为19724495、19783102、19398380和18860495。(8)对miRNAs的表达情况进行分析,HS_20-vs-HS_35的差异表达miRNA有151个,其中上调miRNA有100个,下调miRNA有51个;HS_35-vs-HS_50的差异表达miRNA有153个,其中上调miRNA有40个,下调miRNA有113个;HS_50-vs-HS_60的差异表达miRNA有146个,其中上调miRNA有88个,下调miRNA有58个。(9)筛选到一些可能参与花生油脂和贮藏蛋白合成调控的差异表达miRNAs。分别属于miR156b家族(ahy-miR156b-3p和ahy-miR156b-5p),miR156c家族(ahy-miR156c)和miR159家族成员(ahy-miR159)。筛选到1个贮藏蛋白基因调控miRNA(基因ahy-miR156a),其靶基因是XM_016083519.2。(10)通过基因的表达量统计和功能注释分析,转录组测序中的差异表达基因和小RNA测序中的差异表达miRNAs,主要参与的生物过程是代谢过程,主要的分子功能是催化活性功能。(11)对转录组测序中的4个差异表达基因和小RNA测序中的4个差异表达miRNAs进行了RT-PCR验证,结果表明,验证结果中基因的表达趋势与测序的结果基本一致。
【图文】：

流程图,文库构建,流程图

底烧瓶的质量（g）；m2：样品的质量（g）；100：换算系数 RNA 的提取 RNA 是采用 Takara 的试剂盒，按说明书进行提取。 RNA 质量的检测糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行检测。升总 RNA，，进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。分光光度计检测其纯度。文库的构建、测序及数据处理建以及测序工作由深圳华大基因科技服务有限公司完成，考文献[91]，文库构建流程如下图所示。

流程图,数据分析,流程图,转录因子

图 2 数据分析流程图Fig.2 The flow chart of data analysis属转录因子的分类注释是一群能与 5’端上游特定序列专一性结合，从而保证目的时间与空间表达的蛋白质分子。通过 getorf 检测 Unigene使用 hmmsearch 将 ORF 比对到转录因子蛋白结构域，根lantTDB）描述的转录因子家族特征对 Unigene 进行能力鉴表达量统计及差异表达基因的筛选KM（Fragments Per kb per Million fragments）来计算基因的的 reads 中匹配到外显子的每 1K 个碱基上的 reads 个数。因在不同样本间的差异表达倍数（Fold change）。差异表 ≤0.001 且倍数差异在 2 倍以上。
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.2

【参考文献】