GmSUMO2基因转化大豆及其在ABA、干旱胁迫下的功能分析

发布时间：2020-05-09 20:09

【摘要】：类泛素小蛋白修饰物(Small Ubiquitin-related Modifier,SUMO)是一种在结构上与泛素类似的小分子蛋白,主要通过共价结合的方式参与蛋白质翻译后修饰过程。SUMO化修饰是一种可逆的级联反应,SUMO前体蛋白通过SUMO蛋白酶的水解,暴露出双甘氨酸结构,形成具有功能的成熟SUMO蛋白,经过E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的作用,能够可逆的将SUMO分子结合到特异的底物蛋白上,从而改变底物的定位、稳定性和活性等,参与并调节细胞的多个生物学过程。在模式生物拟南芥中,SUMO分子在植物生长发育调控、环境胁迫应答与激素信号转导等方面都起着重要的作用;研究室前期研究中已知高温、高盐、ABA等胁迫下大豆蛋白快速发生SUMO化以响应非生物胁迫,但在大豆中,SUMO分子在植物非生物胁迫应答中的具体功能仍未见报道。因此本研究拟通过GmSUMO2基因功能的初步研究,从蛋白翻译后修饰的角度补充完善植物非生物胁迫信号转导途径,并为大豆抗逆分子育种提供植物材料,具有重要的理论研究意义和育种应用价值。本研究首先克隆GmSUMO2基因并进行序列分析,为了便于后续研究中对大豆SUMO化底物进行质谱鉴定,将GmSUMO2分子第94位氨基酸由组氨酸(H)突变为精氨酸(R),增加一个胰蛋白酶识别的精氨酸位点,水解后可获得便于质谱分析的C端多肽标签,同时可将SUMO化底物与泛素化底物区分开。克隆获得GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)后,构建植物表达载体pTF101-6×His-GmSUMO2和pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R),通过发根农杆菌K599诱导大豆毛状根,获得GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)超表达的转基因大豆毛状根,对其进行ABA及干旱胁迫处理,对比在非生物胁迫下的表型差异,分析GmSUMO2基因在大豆非生物胁迫响应中的功能;另外,利用根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了转GmSUMO2基因的大豆PCR阳性植株,为后续深入研究大豆SUMO分子的功能提供了研究材料。本研究取得的主要研究结果如下:(1)克隆了GmSUMO2基因,通过对大豆GmSUMOs基因序列的同源性比较,发现GmSUMO2与拟南芥AtSUMO1相似性极高;对数据库中已有的RNA-Seq数据进行分析,发现GmSUMO2基因在大豆不同的组织中均有表达;通过顺式作用元件分析发现GmSUMO2基因中存在多种非生物胁迫响应元件;利用qRT-PCR对其表达模式进行分析证实GmSUMO2在转录水平上对盐、热、ABA及干旱均有响应。(2)在GmSUMO2基因5’端融合6×His标签序列,并将表达产物C端暴露双甘氨酸结构,同时利用特异性引物PCR扩增的方法,获得第94位氨基酸由H突变为R的点突变形式GmSUMO2(H94R);分别构建了植物表达载体pTF101-6×His-GmSUMO2和pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)并转化发根农杆菌和根癌农杆菌;利用发根农杆菌K599诱导大豆产生毛状根,通过PCR检测和Western blot检测,证实GmSUMO2基因在转基因大豆毛状根中表达,分别获得了转pTF101-6×His-GmSUMO2和转pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)的大豆阳性毛状根;(3)利用0μΜ、15μΜ、25μΜ的ABA和100 mM甘露醇对转基因大豆毛状根进行胁迫处理,(以空菌诱导的毛状根作为对照)。表型分析显示GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)超表达毛状根对ABA的敏感性增强;经qRT-PCR检测,证实GmSUMO2在转基因大豆毛状根中表达显著上调,在ABA处理下GmSUMO2基因上调表达幅度比对照毛状根更大;同时检测了参与ABA信号转导途径的转录因子ABI3/5、SnRK1.1/1.2的相对表达量变化,发现ABI3/5在胁迫处理前后具有相似的表达趋势,在ABA处理下对照毛状根中上调表达极显著,而在转基因大豆毛状根中在15μΜABA处理下相对表达量变化不显著,且显著低于对照毛状根中的相对表达量;当ABA浓度达到25μΜ时,转基因大豆毛状根中ABI3/5的相对表达量显著上调;而SnRK1.1/SnRK1.2在对照毛状根中在ABA处理前后相对表达量变化不显著,在转基因大豆毛状根中相对表达量随着ABA浓度的增加而升高;在干旱胁迫处理下,转基因大豆毛状根的生长受到抑制,qRT-PCR分析表明干旱胁迫相关基因DREB2A在转基因大豆毛状根中显著上调表达,而另一个相关基因bZIP1相对表达量在转基因大豆毛状根和对照毛状根中在胁迫处理前后并无显著差异。此外,结果表明GmSUMO2(H94R)转基因材料和GmSUMO2转基因材料在胁迫处理前后大豆毛状根的表型和基因表达水平方面均无显著区别,证明H94R点突变对GmSUMO2基因功能无影响。(4)利用根癌农杆菌介导的转化方法对大豆品种“东农50”子叶节进行遗传转化,分别获得转pTF101-6×His-GmSUMO2的PCR阳性植株2株和转pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)的PCR阳性植株2株,目前已收获T_1代种子14粒,为后续深入研究大豆SUMO分子的功能提供了前期材料。
【图文】：

模式图,模式图,结合物,热激

利用免疫共沉淀技术已鉴定出受体蛋白的赖氨酸确实是物蛋白的 SUMO 化作用，使底物蛋白的稳定性及蛋白构象发生了细胞内的重新定位、功能、稳定性和活性等多个方面[8]。为真核生物研究的模型，在 SUMO 研究进程中起到了重要的作用统来研究底物蛋白 SUMO 化功能，可以在不同的发育水平上进行可以通过涉及 SUMO 化途径中其他成员的突变体，确定靶蛋白由中实现了植物表型与相关靶蛋白的 SUMO 化状态之间的关联性，现的[4,6]。在酵母和哺乳动物中 SUMO 化修饰相关研究较为早期对滞后，且研究结果主要集中在模式植物拟南芥和水稻中，当植物时 SUMO1/2 结合物水平变化幅度非常大，其中热激 2 分钟内检测生变化证明了其在植物对热胁迫的早期反应，超表达 SUMO2 结合物的积累，表明 SUMO 化是植物胁迫响应的重要特征，，有研37℃中热处理 30 分钟，24℃恢复培养，会迅速的累积 SUMO 结合，结合物水平在 0.5 h-1 h 之间达到最高，4 h 后恢复到正常水平，双突变背景下表达时，结合物水平极低，说明热激会诱导 SUMO1并且由热激诱导的 SUMO 结合物积累在细胞核中[7]。

技术路线图,技术路线,毛状根

东北农业大学理学硕士学位论文根，经 PCR、qRT-PCR 检测以及 Western blot 检测，分别获得转 pTF101-6×His-GmSUMO2 和转 pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的阳性毛状根；植物表达载体转入根癌农杆菌 EHA105并介导对大豆的遗传转化，分别获得转 pTF101-6×His-GmSUMO2 和转 pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的 PCR 阳性植株；获得 PCR 阳性的 T0代转基因大豆株系；（4）抗逆性分析：对转 pTF101-6×His-GmSUMO2 和转 pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的阳性毛状根进行 0 μΜ，15 μΜ，25 μΜ 的 ABA 和 100 mM 甘露醇的非生物胁迫（以 K599空菌诱导的毛状根作为对照），对比分析表型；通过 qRT-PCR 分析胁迫相关基因的表达量变化，分析其在非生物胁迫下的功能。1.3.2 技术路线
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.1

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