丹东蒲公英绿原酸生物合成关键酶TaHQTs调控研究

发布时间：2020-05-15 05:20

【摘要】：蒲公英(Taraxacum F.H.Wigg)广泛分布于世界各地,是菊科植物舌状花亚科最进化类群之一。绿原酸是蒲公英主要生物活性成分之一,具有抗氧化、消炎、抗菌、抗病毒等作用。蒲公英中绿原酸生物合成机制尚未见报道,绿原酸生物合成途径的研究可以为提高其药用价值奠定基础。本论文以东北地区丹东蒲公英(Taraxacum antungense Kitag.)为研究材料,以沈阳农业大学种质资源异位保存圃为研究地点,克隆获得绿原酸生物合成途径的关键限速酶基因TaHQT1和TaHQT2,遗传转化获得TaHQT1过表达株系和RNAi株系后进行分析并评价株系的稳定性,评价植物的抗氧化能力。原核表达获得TaHQT1/2蛋白,测定蛋白酶活动力学参数并比较蛋白酶对绿原酸合成的影响。克隆获得TaHQT2基因启动子并分析其顺式作用元件,为研究绿原酸生物合成途径的转录调控机制奠定基础。克隆获得TaMYC1转录因子,酵母单杂交确定TaMYC1能与TaHQT2启动子结合,酵母双杂交筛选获得TaMYB59转录因子,为明确转录因子调控绿原酸生物合成途径奠定基础。主要结果如下:1.同源克隆获得了TaHQT1和TaHQT2基因,构建了pCAMBIA1300-35S-X-TaHQTs RNAi载体并获得其转基因株系。TaHQT1和TaHQT2 RNAi愈伤组织中绿原酸含量下降了39.74%和47.09%。因此,TaHQT2基因对绿原酸生物合成影响效果更好。TaHQT2构建pRI101-AN过表达载体并获得转基因株系,分析发现绿原酸含量与对照组相比增加了82.49%,咖啡酸含量差异不显著。qRT-PCR分析发现TaHQT1和TaHQT2基因在根和叶中的表达量与绿原酸含量成正相关,上述结果表明TaHQT1和TaHQT2正调控绿原酸的生物合成。2.对TaHQT2转基因丹东蒲公英进行盐胁迫处理,测定各处理MDA酶活性,脯氨酸和总叶绿素含量。200 mM NaCl处理前后,过表达株系MDA含量增加了96%,对照组(296.6%)和RNAi干扰组(310.6%);过表达株系谷氨酸(proline)含量增加了51.5%,对照组(403.6%)和RNAi干扰组(562.7%);TaHQT2过表达株系绿原酸含量高于对照组和RNAi干扰组。结果显示TaHQT2过表达株系的盐胁迫能力高于对照组和RNAi株系。3.亚细胞定位确定TaHQT1定位于细胞核,TaHQT2定位于细胞核和细胞质。构建原核表达载体pET32a-TaHQT1/2后,经过原核表达纯化和western blot确定了纯化的融合蛋白分子量大小为65Kd,酶动力学参数确定TaHQT1和TaHQT2均能够在体外催化咖啡酰辅酶a与奎尼酸形成绿原酸。4.克隆获得TaHQT2基因的启动子,分析确定proTaHQT2含有4个E-box,且可能受到MeJA调控;克隆获得TaMYC1转录因子,MeJA诱导下TaMYC1和TaHQT1/2基因表达量均显著增加。按照上述方法确定TaMYC1可促进绿原酸的生物合成。qRT-PCR确定TaMYC1提高苯丙氨酸合成途径的TaC4H、Ta4CL和TaHQT2基因的表达量。酵母单杂交确定TaMYC1能够通过结合proTaHQT2从而调控绿原酸的生物合成。5.构建丹东蒲公英酵母cDNA文库,并进行文库质量评价。构建了BD-TaMYC1诱饵载体并进行筛库,筛选出一个R2R3-MYB转录因子并命名为TaMYB59。点对点双杂交确定TaMYC1能与TaMYB59进行互作。
【图文】：

第一章 文献综述Li et al., 2018; Liu et al., 2017）。4-香豆酰-CoA-连接酶（4-coumaroyl-CoA催化对香豆素从而形成对香豆素辅酶 a 进行下游支路，同时也是催化苯丙后一个修饰酶，由多种同工酶共同催化，，并且受到外界环境因子的作用。已病原菌的作用下可以受到生物胁迫从而诱导类黄酮的合成（Khakdan et al4H 和 4CL 是苯丙氨酸合成途径的关键限速酶，同时为下游苯丙氨酸代谢代谢途径提供作用底物（Yuan et al., 2014）。如查尔酮合成酶（Chalcone s催化对香豆素辅酶 a 向黄酮类和类黄酮类化合物的进行，而 HCT/F3H 催辅酶 a 向绿原酸和咖啡酸生物合成途径进行。

技术路线
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239

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本文编号：2664533