马铃薯淀粉酶StBAM9互作蛋白的分离与鉴定

发布时间：2020-05-23 04:08

【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)因其丰富全面的营养得到广泛的使用,其加工产业中的高附加值产品薯条薯片等,因其独特的风味而备受人们喜爱,然而马铃薯中的低温糖化现象严重阻碍了薯条薯片等油炸加工产品的发展。淀粉是马铃薯块茎的主要储能形式,前人研究表明,淀粉处于淀粉-糖代谢的源头,是造成低温糖化的主要因素之一,其中β-淀粉酶9(StBAM9)尽管检测不到淀粉酶活性,但对马铃薯的低温糖化有着重要作用,为了研究这类无β-淀粉酶活性的蛋白是发挥功能的机制,本研究主要从蛋白水平对StBAM9互作蛋白进行了分离,并完成了验证及互作机制解析,主要研究结果如下:1.利用马铃薯低温糖化酵母文库对StBAM9的互作蛋白进行了筛选,得到了92个与StBAM9和StBAM9-P互作的蛋白,其中与StBAM9和StBAM9-P都互作的蛋白有12个,通过WEGO分析,两者的潜在互作蛋白在定位、分子功能以及生物学途径上相似,主要定位在细胞内,大多数是具有催化活性和结合功能的蛋白,且大部分蛋白富集在细胞、代谢、生物调控以及对刺激的响应的生物学途径上。通过酵母点对点验证,初步得到4个互作蛋白分别是StDUF842、StTPR01660、StTPR22129和StTPR45174。2.为了明确StDUF842、StTPR01660、StTPR22129和StTPR45174在马铃薯栽培种E3中不同组织及块茎低温处理下的表达模式,我们通过qRT-PCR进行定量分析,得到StDUF842、StTPR22129在叶片中相对表达量高,StTPR01660在叶片和成熟的薯块中相对表达量高,StTPR4517334在成熟薯块中相对表达量高,其中StTPR01660和StTPR45174与StBAM9类似,在成熟的薯块中表达量高。叶片是马铃薯主要的产能器官,薯块是马铃薯主要的储能器官,推测它们都很有可能参与淀粉的降解。3.为了明确StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174的亚细胞位置,分别构建GFP融合表达载体GFP-StDUF842、GFP-StTPR01660、GFP-StTPR22129、GFP-StTPR45174,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达得到StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174都定位于细胞质。4.为了进一步明确互作蛋白与StBAM9在植物细胞中的互作部位,我们通过BiFC对StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174与StBAM9进行互作验证,发现只有StTPR01660与StBMA9互作于淀粉粒上,另外StTPR01660与定位在质体基质中的β-淀粉酶1(StBAM1)互作于细胞质。另外,GST pull down结果表明StTPR01660与StBAM9有互作,且还发现StTPR45174与StBAM9有着较强的互作。而前期研究表明StBAM9定位在淀粉上,由此我们推测StTPR01660可能在细胞质中与StBAM1互作,形成复合体,并通过StBAM9的招募,到达淀粉粒上,从而实行淀粉粒上淀粉降解的功能;此外,是否存在StTPR45174等其他蛋白参与这个过程,还有待于进一步确定。5.为了明确StTPR01660、StBMA1与StBMA9间互作的区段,我们以不同的StTPR01660短截区段与StBMA9进行酵母点对点实验,结果表明StTPR01660完整的TPR domain区段(第181到277个氨基酸区段)才能与StBMA9互作。通过NCBI对StBAM1进行结构域的预测,发现第1到85个氨基端区段有一个质体转运肽,第111到542个氨基端区段为葡糖基水解酶结构域。通过将水解结构域进行短截,我们得到StBAM1的第330到413个氨基酸区段与StBAM9-P互作。通过NCBI对StBAM9进行结构域的预测,发现第1到63个氨基端区段有一个质体转运肽,第88到506个氨基端区段为葡糖基水解酶结构域。通过将水解结构域进行短截,我们得到StBAM9的第238到386个氨基酸区段与StBAM1互作。StBAM1和StBAM9这两个短截的区段里含有两个相同的底物结合位点(赖氨酸和组氨酸),推测StBAM9可能借助StBAM1行使降解淀粉的功能。6.通过StBAM9干涉株系中直链和支链淀粉含量测定结果表明,在4℃30 d处理条件下,支链淀粉的降解速度比直链淀粉的降解速度慢,StBAM9更青睐于支链淀粉,我们可以进一步通过蛋白体外添加实验,明确互作蛋白与StBAM9可能的功能机制。此外,StBAM9干涉株系及对照的淀粉磷含量测定结果表明干涉株系与对照E3相比无显著差异,说明StBAM9调控的淀粉降解可能不是通过淀粉磷酸化的途径。
【图文】：

合成模,支链淀粉,造粉体,支链

绿体和造粉体是植物合成淀粉的主要场所。光合作用旺盛时，叶绿体可和累积淀粉（瞬时淀粉），暂时贮藏，为植物呼吸、蔗糖合成等提供碳an et al 1999），同时非光合组织也可以通过运输到植物的子叶、胚乳、茎等器官的贮藏细胞中的葡萄糖或蔗糖，在造粉体中合成淀粉粒，贮藏 1）。淀粉的合成主要包括直链淀粉的合成和支链淀粉的合成，其中直要是由颗粒性淀粉合酶（GBSS）完成（Visser et al 1991），而支链淀分支酶（branching enzyme, BE），可溶性淀粉合酶（starch synthase, S（branching enzymes, DBE）等多个淀粉合成同工酶协同完成（Jeon。在葡聚糖开始阶段，，最初合成直链麦芽低聚糖和具有无规分支的麦芽着合成具有簇状结构的支链麦芽糖糊精，其可以作为正常支链淀粉分子的引物，从而不断引发支链的合成，支链淀粉和直链淀粉一起形成半结不溶性的淀粉颗粒。

叶绿体,途径,麦芽糖,脱支酶

解处于淀粉-糖代谢的源头，是细胞中可溶性糖类形成的最是一个十分复杂的过程，是多个酶协同作用的结果（图 2粉通过两种途径降解：一是淀粉的酶促水解，一是淀粉的磷的瞬时淀粉可以通过α-淀粉酶等将葡聚糖水解成麦芽糖和葡can, water dikinase（GWD）和 Phosphoglucan, water dikinas粉葡萄糖残基中的 C6 和 C3 的磷酸化，使淀粉分子的空间在脱支酶如 ISA3 作用下脱去分支，产生麦芽糖；或者在磷ess（SEX4）作用下使得淀粉葡萄糖残基中的 C6 和 C3 脱去糖链，然后在β-淀粉酶淀粉酶作用下水解成麦芽糖以及极限脱支酶（branching enzymes, DBE）切割α-1, 6 糖苷键进一步芽糖由麦芽糖转运蛋白转运细胞质经葡糖糖苷转移酶水解萄糖转运蛋白运输出叶绿体（Samuel et al 2010; Zhang et a
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S532

【参考文献】