甘蓝型油菜Bna-miR845在响应干旱胁迫中的功能研究

发布时间：2020-06-01 09:23

【摘要】：干旱胁迫是制约我国甘蓝型油菜生产的重要非生物胁迫。甘蓝型油菜在整个生长期间需水量大,对干旱的适应性差,因此选育耐旱的新品种对油菜增质增产就显得非常重要。植物对干旱胁迫的响应主要是通过调控相关基因的表达产生一系列生理生化反应来实现的,miRNA能够在转录水平和转录后水平对基因的表达进行调控,进而参与调控植株生长发育和对各种非生物胁迫产生响应。本研究鉴定了一种在PEG模拟干旱胁迫下显著诱导表达的Bna-miR845,它可能参与甘蓝型油菜应答干旱胁迫的调控过程。之后,为了验证其功能,我们又利用农杆菌介导的甘蓝型油菜的遗传转化体系,探究过表达Bna-miR845的阳性株系在干旱胁迫下的生理生化变化和耐旱的分子机制,主要的研究结果如下:1.通过northern blot实验,证实Bna-miR845为前体序列100 bp,成熟序列为20 bp的miRNA,通过5'-RLM-RACE实验验证了BnATP9为其靶基因之一。2.对甘蓝型油菜种植品种进行PEG模拟干旱处理,取其叶片进行表达量检测分析,发现干旱处理后Bna-miR845出现显著上调表达。结果说明,miR845受到干旱胁迫的诱导表达,可能参与了植物响应干旱胁迫的应答过程。3.对Bna-miR845在甘蓝型油菜不同组织中的表达进行分析,发现Bna-miR845在叶、根、花苞、花和角果中的表达量均比较高,其靶基因BnATP9在叶、根、花苞、花和角果中的表达都较高,表明Bna-miR845可能在甘蓝型油菜发育的不同时期和组织中发挥重要的调控作用。利用烟草叶片瞬时表达系统对靶基因BnATP9的亚细胞定位情况进行分析,发现其定位在细胞质中。4.构建了 Bna-miR845及其靶基因BnATP9的过表达载体,并通过农杆菌介导的甘蓝型油菜的遗传转化实验获得了阳性植株。对野生型和Bna-miR845过表达株系T2代植株进行ABA处理,发现ABA处理后Bna-miR845过表达植株的根长显著长于野生型植株。qPCR分析发现Bna-miR845出现显著上调表达,靶基因BnATP9显著下调表达,说明Bna-miR845受ABA诱导表达,负调控BATP9。5.对Bna-miR845过表达植株和野生型植株同时进行干旱处理,并对处理前后植株中的各项生理指标以及基因表达情况进行检测分析。结果显示,Bna-miR845过表达植株中RWC,POD、SOD活性和Pro含量都高于野生型,而MDA含量和REC则相反,显著小于对照。说明Bna-miR845过表达植株在干旱胁迫下,通过更加积极的调动植株体内过氧化物保护酶活性,增加渗透调节物质的生物合成等途径来减小干旱胁迫所造成的损伤。qPCR分析发现,干旱处理后Bna-miR845过表达植株和野生型植株中Bna-miR845的表达量逐渐升高,且Bna-miR845过表达植株中Bna-miR845的表达量相较于干旱处理前比高于野生型植株高出更多。靶基因BnATP9在野生型植株中表达显著下调,而在Bna-miR845过表达植株中的表达几乎完全被抑制。结果说明,Bna-miR845可能受到干旱胁迫的诱导表达,从而调控靶基因BnATP9,抑制其表达。6.对Bna-miR845过表达植株和野生型植株叶片的气孔进行观察,发现与野生型相比,Bna-miR845过表达植株无论是上表皮还是下表皮上的气孔密度都出现显著减少。对其中气孔发育相关的基因进行表达量的检测,发现负调控气孔发育的基因TMM,ER,ERL1和ERL2均表现出上调表达,而正调控气孔发育的基因SPCH和MUTE表现出下调表达,这与叶片上气孔的密度显著减少的现象是一致的。这就说明Bna-miR845过表达植株还可能通过降低气孔密度,减少叶片水份蒸腾从而增强了油菜对缺水的耐受性。综上所述,甘蓝型油菜Bna-miR845过表达植株在干旱胁迫下,一方面可通过调节其ROS清除系统的活性来减少MDA的积累,另一方面还可以通过减少其气孔的数量和密度,来减少水分的散失,从而表现出更好的抗旱性。
【图文】：

野生型,植株,诱导表达

ＰＥＧ６０００胁迫后Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的表达量均显著上调，胁迫第２４邋ｈ相比第０邋ｈ表达量上调５逡逑倍以上，胁迫第４８邋ｈ表达量上调了邋１５倍以上，结果说明Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在“甲９７１２”和“扬逡逑９”这两个种植品种中确实受到ＰＥＧ胁迫的诱导表达（图３．３）。逡逑２0＂｜邋■，．甲邋９７１２＂逡逑0逦口邋”扬９”逦Ａ邋Ｉ逡逑ｗ邋１５－逦■逡逑卜」ｎｌｌ逡逑ｖ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑＇Ｏ逦？＊0逦＇Ｏ逡逑图３．３野生型植株受到ＰＥＧ胁迫后Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的表达分析逡逑

油菜,甘蓝型油菜,靶基因

取甘蓝型油菜不同发育时期的不同组织或器官，进行ＲＮＡ的提取，，并对逡逑Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５表达量进行检测。结果显不，Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在叶、根、花荀、花和角果中逡逑的表达量均比较高（图３．２），这也就表明Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５可能在甘蓝型油菜发育的不逡逑同时期和不同组织中均可能发挥一定的调控作用。逡逑Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５逡逑ｉｌｙｉＬ逡逑图３．４Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在油菜不同组织中的表达分析逡逑Ｆｉｇ邋．邋３．４邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｎａｐｕｓ逡逑３．４逦Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５靶基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达分析逡逑根据５’－ＲＬＭ－ＲＡＣＥ的结果，确定他４７Ｐ９为Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的靶基因，并对它在不同组逡逑织的表达量进行测定分析，从定量结果（图３．４）来看，扮在种子中的表达量最高，逡逑叶、根、花、花苞和角果中的表达量次之。说明在甘蓝型油菜的生长发育进程可逡逑能也发挥着重要作用。逡逑ＢｎＡＴＰ９逡逑ｊ邋■ｌｉｉ．ｍｉｌ逡逑ｕ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑0°逡逑ｙ逡逑图３．５逦在油菜不同组织中的表达分析逡逑Ｆｉｇ．邋３．５邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢｎＡＴＰ９邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｎａｐｕｓ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.4

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