蒙古冰草抗旱相关microRNA挖掘与功能验证

发布时间：2020-06-02 04:31

【摘要】：蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)属小麦族的二倍体多年生牧草,抗旱性极强,在我国北方干旱草原及半荒漠地区天然草场补播改良和旱作人工草地建植中占有重要位置,且蕴含麦类作物遗传改良的宝贵基因资源。microRNA是植物体内普遍存在的非编码RNA,参与调控干旱、盐害、寒冷等多种逆境胁迫响应。针对蒙古冰草抗旱相关miRNA这一研究的空白,本试验构建干旱胁迫下蒙古冰草small RNA文库,通过Solexa高通量测序及生物信息学分析筛选与抗旱显著相关的miRNA;利用stem-loop real-time PCR技术对7个抗旱相关的miRNA进行定量验证,并利用Target Finder软件和psRNATarget数据库进行靶基因预测;构建miRNA的过表达载体,利用农杆菌介导法转入拟南芥,验证miRNA的抗旱功能,这为深入研究蒙古冰草miRNA抗旱分子机制及牧草分子育种奠定基础。主要研究结果如下:1、蒙古冰草中共筛选得到114个新miRNA,其中保守的53个、非保守的61个,差异表达的有17个。2、蒙古冰草中7个差异表达的miRNA在蒙古冰草中预测到17个靶基因,在拟南芥中预测到60个靶基因,大多参与干旱逆境胁迫响应。3、蒙古冰草7个miRNA在对照和干旱处理的情况下,amo-miR21、amo-miR62、amo-miR82、amo-miR5和amo-miR77的表达量随着干旱时间的延长均呈上调趋势,而amo-miR44与amo-miR17的表达量呈下调趋势,与测序结果一致。4、成功构建蒙古冰草7个miRNA的表达载体:pBI121-amo-miR21、pBI121-amo-miR5、pBI121-amo-miR62、pBI121-amo-miR44、pBI121-amo-miR82、pBI121-amo-miR17和pBI121-amo-miR7。5、得到了转基因拟南芥抗性植株,蒙古冰草3个抗旱相关miRNA(amo-miR21、amo-miR5、amo-miR62)可稳定遗传,且调控表达趋势与蒙古冰草中相同。
【图文】：

内蒙古农业大学硕士学位论文核内，被 DCL1（Dicer-like1）等酶剪切为发卡状的 pre- Hasty（HST）和其他的一些蛋白因子的作用下被转运到切作用下形成 miRNA/miRNA*复合体，随后在 HEN1 等RNA；成熟的 miRNA 诱导沉默复合体（RNA-induced sile的靶 mRNA 结合，调控基因表达[38-41]。

为起始样品，small RNA的3’端加上接头，添加反转录引物，然后加5’接头，反转录成cDNA，随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离目标片段，切胶回收得到的即为cDNA文库（图2）。图 2 文库构建原理图Fig.2 The principle diagram of library construction文库建成后，用Qubit2.0初步定量，稀释文库至2ng/ul，对文库进行insert size检测，用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），，以保证文库
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S543.9

【参考文献】

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本文编号：2692612