叶绿体迁移基因CRD1的互作蛋白CIP2的功能研究

发布时间：2020-06-03 02:27

【摘要】：对于像我国这样的人口大国,粮食生产一直是全民关注的焦点,而我国60%作物种植以水稻为主。因此如何有效提高水稻产量已成为农业生产中最急需解决的关键问题。提高水稻产量有多条途径,其中最直接有效的手段就是增强叶片捕获光能的能力,以便提高光合作用,产生更多有机物。近年来,叶色突变体的出现,使我们对植物叶绿体合成情况、发育机制有了重新的认识。为了研究水稻光信号转导机制,我们实验室通过正向遗传学的方法,克隆了一个控制株高和叶绿体移动的基因CRD1,为了进一步研究CRD1在叶绿体发育、细胞伸长等方面的功能,本实验进行免疫共沉淀筛到了CRD1的互作蛋白CIP2。通过质谱分析,发现CIP2是一类叶绿体GTP结合蛋白,其在调控叶绿体合成、高光下叶绿体移动上有重要功能。首先,为了验证CIP2同CRD1的互作事实,我们通过双分子荧光互补实验、Pull-down以及酵母双杂分别证实了CIP2跟CRD1的FH1+2结构域存在互作关系。其次组织部位表达分析,发现CIP2在水稻叶片、叶鞘中都有较高的表达量,在水稻根中的表达量最低。亚细胞定位发现其定位在叶绿体,且跟CRD1共定位时,CIP2荧光信号会从叶绿体转移到质膜上。最后为了研究CIP2的形态及功能,我们利用micro-RNA技术创制了cip2-ami突变体。研究发现cip2-ami表现出淡黄叶,叶绿素含量降低表型。此外,RNA、蛋白水平表达量检测发现,在cip2-ami中CRD1上调表达,而crd1突变体中CIP2表达量也会上调,暗示二者功能上可能具有相关性。但是二者具体遗传学的上下游关系,还有待进一步探究。白条斑实验发现,在cip2-ami中白条斑出现的比野生型早,说明cip2-ami中叶绿体对强光反应更敏感,而crd1则表现出对高光不敏感表型,因此推测CIP2是参与叶绿体避光反应中的一个新的成员。总之,通过本实验,我们发现CIP2是一个参与CRD1介导的叶绿体移动的新组分。CRD1与CIP2互作及它们参与的调控叶绿体迁移的机制,将为研究高光效育种、实现作物增产具有重要的理论意义。
【图文】：

生物合成途径,叶绿素,原卟啉,叶绿素合成

环状尿卟啉原 III 可与亚铁结合形成亚铁血红素，与镁原卟啉[29,30]。镁原卟啉添上一个甲基，环化成原脱植醇基叶绿素成叶绿素 a，而叶绿素 b 则是由少部分叶绿素 a 转化而来。整个点受到阻断，阻断位点前面的物质会不断累积无法作为底物供应点后面的产物会越来越少以致后面的过程都不能运行。经过对叶段的剖析，研究者对于由叶绿素合成受阻引起的突变体大约总结律：在白化无法转绿的突变体中，受阻位点大多发生在叶绿素合UroIII 之间；而可以转绿的白化突变体中，主要是 Pchl 跟 Chla 之。随着研究的不断深入，，人们对叶绿素合成机制将会越来越清晰病变时可以第一时间推算出问题所在，有助于更快更有效的想到进一步研究叶色突变体，提高光能利用率，增加光吸收提高产量

蛋白,双分子,互作,互补技术

图 2.3.1Co-IP-MS 筛到 CIP2 蛋白Fig 2.3.1 Co-IP-MS sieve to CIP2 protein(a)免疫共沉淀筛到互作蛋白 CIP2; (b) CIP2 的蛋白质谱分析(a)Immunoprecipitation screening to the interacting protein CIP2;(b) Protein profiling of CIP22.3.2 双分子荧光素酶互补成像实验前面我们用 Co-IP 的方法筛选到了 CRD1 的互作蛋白之一 CIP2，但是 Co-IP只能粗略的说明这两者之间存在相互作用，而这种作用是直接还是间接的我们并不知道。为了进一步研究 CRD1 跟 CIP2 之间的相互作用，我们利用双分子荧光互补技术（BiFC）[70]，探究植物体内蛋白质之间的互作关系。近年来基于荧光蛋白的深入探究，一些生物荧光研究互作的方法应运而生，其中主要应用到的有荧光共振能量转移（FRET）、双分子荧光互补技术（BiFC）等。基于 BiFC[71]的原理，选取荧光蛋白的特异性位点，沿此切成 N 端和 C 端两个多肽，而这两段独自存在的时候并不能发出荧光，但是当 N 和 C 端分别连到
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511

【参考文献】