水稻种子特异表达核因子Y（NF-Y）转录因子的功能和分子机理研究

发布时间：2020-06-03 09:24

【摘要】：稻米是全球近一半人口的主食。提高水稻产量和改善稻米品质是水稻基础研究和生产实践中的两个关键科学问题。水稻种子大小/粒形直接影响水稻的产量,胚乳中淀粉和贮藏蛋白的含量与稻米的品质息息相关。近年来,影响水稻粒形和种子贮藏物质积累的基因时有报道,然而这两个重要性状的转录调控机制和调控网络仍不明确。核因子Y(NF-Y)作为一类转录因子,参与调控植物生长发育的多个过程。本研究选取5个水稻种子/胚乳特异表达的NF-Y基因(NF-YA8,NF-YB1,NF-YB9,NF-YC10和NF-YC12),通过创建基因表达抑制、基因功能缺失突变体和超量表达等遗传材料来鉴定它们在水稻种子/胚乳发育中的功能,并对其调控机理进行了解析。主要结果如下:1.通过分析5个胚乳特异表达的NF-Y基因在水稻中花11中的表达模式,发现它们的表达具有胚乳特异性,此结果初步表明:水稻胚乳特异NF-Y基因可能参与水稻胚乳发育的调控。本研究中,我们利用RNAi技术和CRISPR技术创建了这5个胚乳特异NF-Y基因的转基因遗传材料,其中有2个基因的RNAi转基因材料和5个基因的基因敲除突变体;同时还创建了2个基因的超表达材料。2.水稻种子特异表达因子NF-YC12是水稻贮藏物质积累的关键调节因子。NFYC12编码一个NF-Y转录因子C亚基,qRT-PCR结果显示其在受精后7 14天的种子中高表达,原位杂交实验表明NF-YC12主要在种子糊粉层和淀粉胚乳部位表达。NF-YC12突变导致粒重显著降低,种子垩白增加。扫描电镜观察显示nf-yc12突变体成熟种子的淀粉颗粒形态异常、呈不规则排列。透射电镜观察结果表明nf-yc12突变体中淀粉颗粒的形成受到影响。此外,nf-yc12突变体中淀粉、直链淀粉和醇溶蛋白的含量均显著降低,谷蛋白含量有所升高;淀粉的理化性质(如支链淀粉的链长分布和淀粉的糊化特性)也发生改变。超表达NF-YC12能显著提高种子粒形和粒重,同时超表达材料中种子贮藏物质的积累也发生了变化。RNA-seq分析显示,nf-yc12突变体中下调的差异表达基因与淀粉生物合成和能量储备代谢过程相关,qRT-PCR结果显示,参与水稻种子淀粉合成和蛋白合成的基因在nf-yc12中的表达量明显低于野生型,以上表明NF-YC12在水稻种子贮藏物质的合成和积累过程中起作用。结合ChIP-seq和RNA-seq结果分析,通过ChIP-qPCR和酵母单杂交等实验证明了NF-YC12能直接结合OsSUT1(Sucrose Transporter)、OsGS1;3(Glutamine Synthetase1)和FLO6(FLOURY ENDOSPERM6)的启动子。同时qRT-PCR结果显示在nf-yc12突变体中,这3个基因的表达出现明显的下调,表明OsGS1;3、OsSUT1和FLO6是NF-YC12直接作用的靶基因。NF-YC12和NF-YB1在体内/外均能发生互作,结合两者的表达模式的异同,我们解析了围绕NF-YC12-NF-YB1参与调控胚乳发育和贮藏物质积累过程的转录调控网络。在糊粉层中,NF-YC12与NF-YB1互作,协同调控蔗糖转运蛋白OsSUT1的功能,此外NF-YC12通过直接结合并调控FLO6和OsGS1;3的表达,来调节胚乳中贮藏物质的合成和积累。3.水稻种子糊粉层特异表达因子NF-YB1调控胚乳发育和水稻灌浆。NF-YB1编码NF-Y转录因子B亚基,在水稻种子糊粉层特异表达。NF-YB1表达下调或上调均导致种子垩白的增加,说明NF-YB1表达的改变影响稻米的品质。NF-YB1表达的改变不影响种子糊粉层的发育。NF-YB1表达下调导致种子淀粉颗粒形态发生异常。与野生型相比,nf-yb1突变体(利用CRISPR创建的NF-YB1 knock-out突变体)种子粒重显著降低,垩白率明显增加。此外,nf-yb1突变体中总淀粉和直链淀粉的含量明显降低,支链淀粉的链长分布发生改变。以上结果表明,NF-YB1在水稻胚乳发育和籽粒灌浆过程中发挥重要的作用。4.水稻种子优势表达基因NF-YC10调节水稻种子大小。NF-YC10具有胚乳优势表达的模式,qRT-PCR和原位杂交实验结果显示NF-YC10在受精后5 10天的胚乳中高表达。NF-YC10蛋白定位于细胞核中,且该蛋白具有转录激活活性。利用CRISPR基因敲除NF-YC10或RNAi抑制NF-YC10表达均产生小粒种子,粒重和粒宽明显降低/减少。NF-YC10调控粒形可能是通过调节粒形相关基因的表达来完成的。我们的研究鉴定了一个调控水稻粒形的新因子NF-YC10,其具有提高水稻种子大小和产量的潜力。5.水稻NF-YA8基因的表达模式和功能研究。NF-YA8启动子融合GUS报告基因实验表明NF-YA8只在胚乳最外围的糊粉层中表达。qRT-PCR结果显示,NF-YA8在种子发育的中后期高表达,在受精后7 10天达到峰值,与GUS染色分析的结果相一致,这说明NF-YA8是一个糊粉层特异表达的基因。NF-YA8-GFP蛋白定位在细胞核中。酵母双杂交结果显示NF-YA8与NF-YB1和NF-YC12均不发生互作。NF-YA8突变之后种子外观没有发生异常。
【图文】：

水稻种子,动态过程,种皮,胚乳

稻种子的生长发育稻作为全球近一半人口的主要粮食来源，同时也是最重要的作物之一(Zuo)。去掉谷壳的水稻种子主要由果皮（pericarp）、种皮（teasta）、胚（embry（endosperm）组成，其中果皮和种皮是由母本组织发育而来，由珠被和珠是珠心表皮）形成种皮，，由子房壁形成果皮。胚和胚乳是双受精的产物，精卵形成，胚乳是由受精极核形成的(SabelliandLarkins2009;Wuetal201发育是随着种子发育同步进行的。水稻种子发育主要分为 4 个阶段：I. 胚期（0 2DAP），此时的胚乳细胞正经历有丝分裂；II. 细胞化时期（3 5DAP向四周产生 12-15 层胚乳细胞；III. 贮藏物质积累期（6 20DAP），胚乳中淀粉和蛋白等物质；IV. 种子成熟期（21 30 DAP），此时胚乳充实，直到和鲜重不再增加，形成成熟的种子（图 1）(Agarwaletal2011;Wuetal2016

水稻种子,基本结构,胚乳

华中农业大学 2019 届博士研究生学位（毕业）论文组织都用颜色来标注；深绿色方框表示胚乳细胞处于活着的状态，浅蓝色方框表示胚乳细胞正在发生程序性细胞死亡（PCD），紧跟其后没有颜色的方框表示细胞已不具有活性。CV，中央大液泡；DV，背部维管束；EN，胚乳；NU，珠心组织；P，果皮；SE，淀粉胚乳；T，种皮。Fig. 1 The dynamic changes of the rice seed development (Agarwal et al 2011; Wu et al 2016b)Changes in endosperm tissues at overall level and transversal sections during seed development arillustrated. Boxes underneath the drawing represent individual DAP. Major tissues are color-codedBoxesfilledindarkgreenindicateendospermcellsthatarealive,boxesinpalegreenindicateendospermcells are undergoingPCD, and boxeslacking color represent cells thathave losttheir membrane integritCV, central vacuole; DV, dorsal vascular tissue; EN, endosperm; NU, nucellar; P, pericarp; SE, starchendosperm; T, testa.作为水稻主要的贮藏组织，胚乳占据了种子大部分的空间。一个发育完整的胚乳主要由最外围的糊粉层（aleuronelayer，AL）和里层的淀粉胚乳（starchendosperm，SE）组成（图 2）(Zuo and Li 2014; Ishimaru et al 2015)。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511

【相似文献】