苦豆子内生真菌对宿主生物碱合成积累的信号传导研究

发布时间：2020-06-03 19:38

【摘要】：内生真菌诱导子作为一种特殊的化学信号,可诱发植物细胞产生一系列与信号分子相关的生理生化效应,进而诱导特定的基因表达,激活次生代谢途径中关键酶的活性,最终导致次生代谢产物的含量发生变化。然而,目前有关内生真菌诱导子诱导药用植物次生代谢产物合成的信号转导等相关机制尚不完全清楚。本研究以苦豆子组培苗为研究对象,4株苦豆子内生真菌的菌液浓缩物为真菌诱导子,考察其对苦豆子组培苗中氧化苦参碱(Oxymatrine,OMA)合成的影响,通过测定内生真菌诱导苦豆子中防御酶的活性,探究内生真菌促进生物碱合成积累的生理防卫反应机制;在内生真菌诱导子作用下,分析宿主中主要信号分子和次生代谢物OMA含量的变化规律,初步探讨苦豆子内生真菌诱导子对宿主中关键信号分子及生物碱的影响;利用实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR),建立检测苦豆子生物碱合成关键酶一赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)基因表达的方法,研究内生真菌诱导子对宿主中生物碱合成关键酶基因表达的影响,在此基础上,分析该基因的表达与宿主中OMA含量及信号分子之间的关系,揭示内生真菌诱导苦豆子生物碱合成积累的作用机制。结果如下:1、以苦豆子内生真菌的菌液浓缩物为诱导子,研究4种不同内生真菌诱导子对苦豆子组培苗OMA的生物合成及生理防卫反应的影响。结果表明:4种苦豆子内生真菌的菌液浓缩物均可提高宿主中OMA含量的积累,其中诱导效果最佳的是内生真菌诱导子XKYKDF40,在0～15d的诱导期间宿主中OMA含量持续增长且始终高于对照,在15 d达到最高,为3.616 mg/g,是对照组15 d的2.09倍。4种内生真菌诱导子还可诱发宿主中3种抗氧化酶(POD、APX和CAT)和生物碱合成关键酶PAL的活性升高。2、在内生真菌诱导子XKZKDF11和XKYKDF40的作用下,分析在不同诱导时间下,宿主中主要信号分子NO、SA和JA含量以及主要活性成分OMA的变化规律,探究内生真菌诱导子诱发的信号分子同OMA含量及防御酶活性变化的关系,结果表明:在内生真菌诱导子XKZKDF11和XKYKDF40处理苦豆子组培苗后,首先诱发了信号分子NO迸发,其次内源SA和JA的释放,他们达到最大值的时间分别在诱导第3、9和12 d,且在诱导过程中,3种信号分子参与调控PAL、APX和CAT活性的变化,随后宿主中OMA含量的达到高峰。可推测NO、SA、JA三者联合介导内生真菌诱导子XKZKDF11和XKYKDF400促进苦豆子OMA的合成。NO的迸发是苦豆子组培苗在内生真菌诱导子处理下出现最早的反应之一,信号分子SA和JA对内生真菌诱导子促进OMA的合成有着拮抗或协调互补的作用。3、根据苦豆子LDC和Lectin基因序列设计目的和内参基因,采用相对定量的方法,优化qRT-PCR反应体系与反应条件,建立苦豆子生物碱合成关键酶—LDC基因表达的检测方法。结果表明:在qRT-PCR体系中cDNA浓度为200ng/μL,退火温度为61℃时检测结果最好;所构建的目的基因QLDC和内参基因Lectin的标准曲线,其循环阈值与模板浓度均呈良好的线性关系,扩增效率都在99%以上;与半定量PCR相比,qRT-PCR的灵敏度提高了 25倍；以内生真菌XKYKDF40菌液浓缩物为诱导子,发现宿主中LDC基因的表达量始终与OMA含量协同增长,在诱导处理第15 d时,LDC基因表达量达到最高,为诱导0d的260.95倍。4、在建立了稳定的qRT-PCR检测苦豆子LDC基因表达反应体系的基础上,分析内生真菌诱导子XKZKDF11对生物碱合成关键酶基因表达的影响,探究LDC基因表达与宿主中OMA含量及信号分子之间的关系。结果表明:内生真菌诱导子XKZKDF11明显促进了宿主中LDC基因的表达,且在各个诱导时间段内,都高于同时期的对照组。在诱导0～12 d内,LDC基因表达量和OMA含量持续增长,在第12 d时LDC基因的表达量达到顶峰,为诱导0 d的394.41倍,是同时期对照组的21.26倍。结合宿主中信号分子的变化情况,发现诱导处理期间JA与LDC基因表达量基本保持同步变化,推测JA参与介导内生真菌诱导子XKZKDF11促进LDC基因的表达。
【图文】：

高效液相色谱,苦参

１６０００００邋－逡逑１４０００００邋－逡逑＾邋１２０００００邋－逡逑Ｉ邋１００００００邋－逡逑，８０００００邋－逡逑＾邋６０００００邋－逡逑４０００００邋－逡逑０逦５逦１０逦１５逦２０逦２５逦３０逡逑时间邋Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ逡逑图２－２苦豆子组培苗中ＯＭＡ的高效液相色谱图逡逑邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＯＭＡ邋ｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋５＊．邋ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ邋Ｌ．邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ逡逑曲线的制备逡逑Ａ标准品２．０邋ｍｇ，用流动相溶解定容至１邋ｍＬ，配制浓度为２邋ｍｇ准Ｐｔ备液，梯度稀释成浓度为２０００、１０００、５００、２００、１００和述色谱条件，吸取标准品溶液进样，，每次进样１０逦以浓度（ｙ），进行线性回归并绘制标准曲线，其回归方程为：ｙ＝７９氧化苦参碱浓度在０．００２￣２．０００ｍｇ／ｍｌ范围内，峰面积线性关系１００００００逦＾７９４邋９邋ｘ＋１１７１３．２邋ｒ２＝0．邋９９９０逡逑

标准曲线,标准曲线,试剂,准曲线

续光照１２ｈ，光强为１０００邋ｌｘ，包括添加诱导子当天在内每３ｄ取１次，共速冻后，－８０°Ｃ保存。逡逑子组培苗中ＮＯ含量测定逡逑Ｇｒｅｉｓｓ试剂法［１４３］测定组培苗中ＮＯ含量，配制ＮａＮ０２标准品溶液，浓度从、２．５、２、１．５、ｌ｜＿ｉｍｏｌ／ｍＬ，绘制ＮａＮ０２＃准曲线。取Ｏ．ｌｇ苦豆子无菌苗子上研磨至匀浆，１００００ｇ，邋４°Ｃ离心１５ｍｉｎ，取上清，置冰上待测，按照表３－１２＃准曲线中计算ＮＯ含量。逡逑表３－１邋ＮＯ含量测定操作表逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ邋ｔａｂｌｅ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＮＯ逡逑试剂名称逦测定管逦空白管样品（叫）逦１００逡逑提取液（ｎｌ）逦１００逡逑试剂一（ｎＬ）逦５０逦５０逡逑试剂二（ｊｉＬ）逦５０逦５０逡逑棍匀，室温静置１０ｍｉｎ，于微量石英比色皿／９６孔板，测定Ａ５５Ｑ下的吸光值，ＡＡ＝ＡＭ－０．０８「邋１逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.2

【参考文献】