林烟草NsylCIPK家族成员的克隆及其与NsylCBL10的互作分析

发布时间：2020-06-14 20:56

【摘要】：植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步传导中发挥重要作用。CBL家族成员CBL10参与植物抵抗高盐胁迫、应对病菌侵染、参与分生组织和花器官发育、调节离子平衡等多个过程,对其下游互作CIPK家族成员的筛选与鉴定对于明确上述调节机制至关重要。为了鉴定林烟草(Nicotiana sylvestris)NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成员,本研究首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtCIPK家族成员和水稻(Oryza sativa)OsCIPK家族成员基因的CDS序列为检索序列,利用NCBI和中国烟草基因组数据库对林烟草中可能存在的NsylCIPK家族成员进行了预测;然后通过RT-PCR方法对预测到的NsylCIPK家族成员进行了克隆并利用生物学分析软件对其基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;最后通过酵母双杂交实验鉴定了与NsylCBL10互作的NsylCIPK家族成员。结果表明,在林烟草中可能存在28个NsylCIPK家族成员,实际克隆获得了20个NsylCIPK家族成员,在酵母双杂交体系中与NsylCBL10互作的只有1个NsylCIPK家族成员NsylCIPK14a。通过PCR以及抗生素抗性筛选鉴定突变体,成功拿到NsylCBL2转烟草突变体、NsylCBL2转拟南芥突变体、拟南芥atcbl3突变体和拟南芥atcbl2atcbl3双突变体。对这些突变体进行了种子发育和离子抗性的分析,结果表明NsylCBL2转拟南芥和转烟草的突变体没有表现出和对照之间的明显的差异。本研究为解析林烟草及其他物种中CBL-CIPK信号通路的调节功能提供了试验数据。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S572
【图文】：

内含子,成员,基因结构,进化树

18图 2.1 NsylCIPK 家族成员邻接系统发育树分析Figure 2.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CIPK family members2.3.2 NsylCIPK 家族成员的克隆及结构分析根据预测的 28 个 NsylCIPK 家族成员的 CDS 序列设计引物，以林烟草 cDNA 为模板，克隆得到了其中的 20 个成员。由于拟南芥 AtCIPK 家族成员的功能研究更为深入，为了方便后续分析和研究，根据与 AtCIPK 家族成员在进化树中亲源关系的远近对克隆获得的 NsylCIPK 家族成员进行命名(表 2.9)。对克隆获得的 20 个 NsylCIPK 家族成员的基因结构进行分析(图 2.2)，结果表明，该家族成员可以根据基因结构分为两类：第一类包括亚家族 Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3 和 Subgroup4中的成员，都具有少内含子特征，仅含有 1~2 个外显子；第二类包括 Subgroup5 中的成员，具有多内含子特征，含有 12~15 个外显子。从进化关系上来看，少内含子成员位于进化树的基部，表明进化初期 NsylCIPK 家族成员含内含子较少，后来逐渐进化出多内含子成员。

结构域,环结构,中非,家族

图 2.2 获得的 NsylCIPK 家族成员的进化和基因结构分析Figure 2.2 Phylogenetic analysis and gene structures of cloned NsylCIPK genes对克隆获得的 20 个 NsylCIPK 家族成员的蛋白保守结构域进行分析(图 2.3)，结果表明，克隆获得的 NsylCIPK 家族所有成员都具有 DFG-APE 激活环结构域、NAF 结构域和 PPI 结构域。说明这三个结构域在 NsylCIPK 家族成员的进化中非常保守，由此可推测它们在 NsylCIPK 发挥正常功能的过程中发挥重大作用。

【相似文献】