丹参SmMYB36基因对萜类和苯丙烷代谢途径调控的研究

发布时间：2020-07-06 16:26

【摘要】：丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又称红根、大红袍等,是草本植物,属于双子叶植物唇形科鼠尾草属。于《神农本草经》、《本草纲目》等均有记载,主要治疗妇科病,具有活血化瘀、调经等功效,此外对神经性衰弱失眠、冠心病、关节痛等均有疗效。丹参的有效药用成分有亲水性的酚酸类物质和亲脂性的丹参酮类物质,其中酚酸类物质包括迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)、丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)和阿魏酸等。丹参酮类物质包括丹参酮I(Tanshinone I)、丹参酮IIA(Tanshinone IIA)、二氢丹参酮I(Dihydrotanshinone I)、隐丹参酮(Cryptotanshinone)等。近几年来,丹参次生代谢途径受到越来越多的关注,本研究以丹参毛状根为模式材料,通过转基因和转录组及代谢组联合分析,尝试探讨丹参SmMYB36基因对萜类和苯丙烷代谢途径调控的机制。1.对SmMYB36进行截短并构建到酵母表达载体,得到pDEST-GADT7-SmMYB36、pDEST-GADT7-SmMYB36~(1-111),pDEST-GADT7-SmMYB36~(112-160),pDEST-GADT7-Sm MYB36~(112-160)。酵母双杂交验证发现SmMYB36全长和C端具有自激活活性,N端不具有自激活活性。2.克隆IIId、IIIe和IIIf家族的SmbHLH基因,将克隆成功的SmbHLH构建到酵母表达载体上,得到pDEST-GADT7-SmbHLH128、pDEST-GADT7-SmbHLH31、pDEST-GADT7-SmbHLH37、pDEST-GADT7-SmbHLH43、pDEST-GADT7-SmbHLH53、pDEST-GBKT7-SmbHLH51和pDEST-GADT7-SmbHLH6,通过酵母双杂交,验证得到SmbHLH128和SmMYB36发生互作。3.构建过表达载体pGWB18-SmMYB36和显性抑制载体pK7WG2R-SRDX-SmMYB36,并诱导得到过表达和显性抑制转基因丹参毛状根。使用高效液相(High performance li-quid chromatography,HPLC)分析转基因丹参毛状根次生代谢物含量,发现pGWB18-SmMYB36过表达丹参稳定的提高了丹参酮类物质:隐丹参酮、丹参酮II A、丹参酮I和二氢丹参酮;而降低了酚酸类物质:迷迭香酸和丹酚酸B。pK7WG2R-SRDX-SmMYB36检测结果与过表达丹参毛状根相反。4.荧光定量PCR分析转基因丹参毛状根次生代谢通路上关键酶基因的表达量。过表达丹参毛状根丹参酮合成途径中,过表达材料的SmCPS1、SmCYP76AH1和SmKSL1的表达量较野生型和空载都有明显升高;酚酸合成途径中,过表达材料的SmPAL1表达量较野生型和空载有明显的下降,SmRAS1和SmCYP98A41表达量没有明显的变化。反之,显性抑制材料的SmCYP76AH1、SmKSL1和SmCPS1表达量较野生型和空载的材料没有明显变化,SmPAL1和SmRAS1的表达量较野生型和空载有明显的升高,但是SmCYP98A41的表达量没有明显的变化。5.对pGWB18-SmMYB36过表达转基因丹参毛状根进行转录组分析,初生代谢中SmGAPDH、SmGPI、SmPEPCK和SmCS表达量降低,SmMDH表达量升高;次生代谢中SmGGPPS、SmTAT1和SmPAL3表达量升高,SmDXS2、Sm4CL2和SmHPPR2表达量降低。代谢组分析得到初生代谢产物无水葡萄糖、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、苹果酸、柠檬酸、延胡索酸。莽草酸和奎宁酸含量升高,琥珀酸、景天庚酮糖-7-磷酸和核糖-5-磷酸降低,次生代谢中二氢丹参酮I和隐丹参酮含量升高,迷迭香酸、丹酚酸C和阿魏酸降低。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
【图文】：

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又称红根、大红袍等，是草本植物，属于多年生叶植物唇形科鼠尾草属，生长于中国北方、韩国和日本等地（Yang et al. 2013；Wenp et al. 2011)）。丹参干燥的根呈细长状，有分支，砖红色，可以入药，《神农本草经本草纲目》等均有记载，主要治疗妇科病，具有活血化瘀、调经等功效，对血瘀的妇女痛经、闭经具有良好的疗效，此外对缺血性心血管病、神经性衰弱失眠、病、关节痛等均有疗效(陈凌霆等 2018; 陈文娟 2016)。丹参的有效药用成分有亲的酚酸类物质和亲脂性的丹参酮类物质，其中酚酸类物质包括迷迭香Rosmarinicacid，RA）、丹酚酸 B（Salvianolic B, SalB）、咖啡酸（Caffeic acid）、丹（Danshensu）、紫草酸（Lithospermic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、原儿茶3,4-Dihydroxybenzaldehyde）、肉桂酸（Cinnamic acid）、对香豆酸（p-Hydroxycinnamcid）和丹酚酸 A（Salvianolic acid A, SalA）等，其中主要药性成分是丹酚酸 B 和迷酸。丹参酮类物质包括丹参酮 I（Tanshinone I）、丹参酮 II A（Tanshinone IIA）、丹参酮 I（Dihydrotanshinone I）、隐丹参酮（Cryptotanshinone）、异隐丹参Isocryptotanshi-none）、丹参酮 IIB（Tanshinone IIB），其分子结构的共同特点是均邻琨或对琨的结构(代晓光和苏长兰 2018; 宋经元等 2013; 王涵等 2018)。

图 1-2 几种丹参酮类化合物的化学结构（张顺仓 2014）.1-2 Chemical structures of some of tanshinones in S. miltiorrhiza（Zhang Shuncang 2参中亲水性的酚酸类物质合成途径目前已经研究的较为透彻，糖酵解（Gy，GP）途径生成 4-磷酸-赤藓糖，戊糖磷酸途径（Pentose phosphate pa生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP），通过醛醇缩合反应（Phenethyl alcohol, DAPH），进入莽草酸循环（Shikimate pathway），发应生成 3-脱氢奎宁酸，一系列反应后生成分支酸，通过预苯酸生成途径(L-Tyrosine)和 L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)，其中 L-酪氨酸通过酪氨酸氨酶（Tyrosine-α-ketoglutarate aminotransferase, TAT）生成了 4-羟苯基ydroxyphenylpyruvate, 4-HPPA ）， 再 通 过 羟 基 苯 丙 酮 酸 还 原 酶 (phenylketate reductase, HPPR)的作用生成了 4-羟基苯乳酸（4-Hydroxyphe4-HPLA）(Hou X et al. 2013; Huang B et al. 2008; W C et al. 2008; Xiao苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成了肉桂酸（T-Cinnamic acid），桂酸-4-羟化酶（Cinnamic acid-4-hydroxylase, C4H）作用生成了 4

图 2-1 电泳检测 PCR 产物er, 1: 克隆得到的 SmMYB361-111片段产物 (B) M: DL2000 ma段产物 (C) M: DL2000 marker, 3: 克隆得到的SmMYB36112-1DL2000 marker, 4: 克隆得到的 SmMYB361-153片段产物Fig. 2-1 Electrophoresis of PCR productsrker, 1: cloned SmMYB361-111fragment products (B) M: DL2000 mment products (C) M: DL2000 marker, 3: cloned SmMYB36112-153) M: DL2000 marker, 4: cloned SmMYB361-153fragment products 截断片段通过 Gatway 构建到表达载体 pDEST-GBKT菌感受态细胞中，对单克隆进行菌液 PCR 鉴定，鉴KT7-SmMYB36 大小约 500 bp，pDEST-GBKT7-SmM， pDEST-GBKT7-SmMYB36112-160大 小 约 mMYB361-153大小约500 bp和pDEST-GBKT7-SmMYB，将重组载体质粒送公司进行测序，测序结果与预期

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本文编号：2743867