灰树花葡聚糖合成酶的基因结构和功能研究

发布时间：2020-07-09 10:39

【摘要】：灰树花(Grifola frondosa)是一种富含多糖和蛋白质等生物活性成分的食药用真菌,其多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化以及抗病毒等作用。本课题组前期研究发现,灰树花发酵胞外多糖主要为葡聚糖,其可能通过UDP-葡萄糖焦磷酸化酶将葡萄糖转化为UDP-葡萄糖,进而经葡聚糖合成酶聚合组装后形成胞外多糖并分泌至胞外。因此,葡聚糖合成酶可能是灰树花合成葡聚糖的关键酶之一。然而,有关灰树花葡聚糖合成酶(Glucan synthase of G.frondosa,GFGLS)的基因结构和功能的研究还未见报道。近年来,随着基因测序技术的发展,特别是灰树花全基因组测序结果和功能注释已公布,为分子水平研究灰树花葡聚糖合成酶GFGLS的基因结构和功能提供必要的信息资源。但目前高效改造灰树花遗传体系的技术手段仍十分匮乏,也限制了灰树花中重要功能基因的研究。因此,本研究首先基于已公布的灰树花基因组序列,设计引物并克隆GFGLS基因序列,对其结构进行生物信息学分析;进而,基于反向遗传学手段,构建高效灰树花基因沉默体系;最后考察GFGLS基因沉默对灰树花深层发酵性能的影响,基本阐明灰树花葡聚糖合成酶的在菌体生长和多糖合成中的主要功能和作用。主要研究结果如下:(1)克隆并运用生物信息学方法系统分析了灰树花葡聚糖合成酶基因GFGLS的结构信息。获得的GFGLS基因为全长5927 bp,与公布的灰树花9006-11菌株的GFGLS基因同源性达到98%。其含有11个内含子及12个外显子,编码蛋白序列全长为5346 bp,共编码1781个氨基酸,分子质量为203.66 kDa。GFGLS编码的蛋白与拟多孔菌、云芝的葡聚糖合成酶同源性相对较高,分别为90.66%和90.38%。蛋白结构域分析表明,GFGLSp有两个与葡聚糖合成酶基因家族一致的保守结构域,分别位于氨基酸残基261-369及761-1576两个位置。亲水性分析发现,GFGLSp为膜蛋白,共含有2个大跨膜结构域,主要包括N末端6个跨膜螺旋(TMHs)和C末端9个TMHs。跨膜结构域由氨基酸残基672-1253组成的亲水性细胞质结构域链接,其中,在氨基酸残基992-995中含有1个底物UDP-葡萄糖的结合位点。(2)建立了灰树花反向双元启动子基因沉默体系。通过克隆得到GFGLS保守区域片段、灰树花GPD启动子片段及构巢曲霉35S启动子片段并成功构建了pAN7-gfgls-dual沉默载体。优化了制备灰树花原生质体的条件即:利用1%丝状真菌破壁酶(购自Takara)和1%溶壁酶(购自广东微生物研究所)的组合酶酶解培养7 d的菌丝体,酶解时间为3 h,在此条件下,原生质体的得率和再生率分别达到最大值,为3.8×10~6个/mL和1.82%。利用电转法成功将基因沉默载体pAN7-gfgls-dual转入灰树花原生质体中,筛选得到10株转化子,经对标记基因HPH的PCR扩增证实9株呈阳性;荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,转化菌株iGFGLS-3中GFGLS表达量下调最为显著,仅为0.26。(3)考察了GFGLS基因沉默对灰树花菌体生长和发酵性能的影响。与出发株(WT)相比,基因沉默菌株iGFGLS-3在PDA平板上生长明显变缓,7-d的平均生长率仅为3.04 mm/d,生长速率下降29.3%。WT菌丝为厚且高度分枝的表型,而iGFGLS-3菌株的长度变短,并且菌丝外观明显变薄。在发酵过程中,iGFGLS-3菌株的外观呈较小尺寸的菌球形态。发酵7 d后,WT菌株的生物量和胞外粗多糖分别为25.12 g/L和1.23 g/L,基因沉默菌株iGFGLS-3的生物量和胞外粗多糖的产量分别降低至5.02 g/L和0.38 g/L。单糖组成分析结果表明,与WT相比,转化菌株iGFGLS-3菌丝体粗多糖和胞内外粗多糖的单糖组成和比例差异不显著。因此,可以推测,灰树花葡聚糖合成酶可能通过影响葡聚糖的合成,干扰了菌丝体骨架,最终影响菌丝体的生长。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.3
【图文】：

葡萄糖激酶,生物合成途径,中数

图 1-1 细菌多糖可能的生物合成途径Fig, 1-1 Proposed synthesis pathway of bacterial polysaccharide图中数字代表各类酶，分别为：1、葡萄糖激酶；2、PGM；3、UGP；4、UGE；5、PGI；6、PMI；7、PMM；8、GMPPB；9、脱水酶和 GDP-岩藻糖合成酶；10、TGP；11、鼠李糖合成酶；12、糖基转移酶；13、聚合酶。相对于细菌多糖而言，目前食用菌多糖的研究主要集中在发酵条件、分离提取等工艺条件优化以及精细化结构解析、功能活性评价等方面的研究，而食用菌合成代谢途径的研究报道十分少，且不够深入。在借鉴细菌多糖合成途径的基础上，刘高强等[51]采用同位素示踪技术结合灵芝多糖主要组分的单糖组成初步推测出了灵芝胞内多糖 IPS-1-1 合成的方式。丁重阳等[52-53]初步构建了灵芝发酵胞外多糖的合成途径，基本确定 PGM、UGP、PGI 和 PMI 是影响灵芝发酵胞外多糖的单糖比例变化的重要酶类，同时也证明了葡萄糖-1-磷酸的添加抑制 PGM、PGI的酶活，对 PMI 无明显影响。朱振元等[54]研究发现，发酵条件会通过扰动蛹虫草菌丝体多糖合成途径相关酶的基因 PGM、UGP 和 PGI 的转录水平，导致其菌

电泳图,葡聚糖合成酶,灰树花,电泳图

图 2-1 灰树花 β-1,3-葡聚糖合成酶基因电泳图lectrophoresis of β-1,3-glucan synthase genes oMaker，1 为 GFGLS1 扩增产物，2 为 GFGL葡聚糖合成酶 GFGLS 基因生物信息学分3-葡聚糖合成酶 GFGLS 基因内外显子分NCBI 中公布的灰树花菌株 9006-11 的在终止密码子，含有两个编码蛋白的读，这与已经公布的其它与灰树花同源性的葡聚糖合成酶的序列不符；进而，利基因所编码的蛋白与其它真菌中的葡聚缺失的分氨基酸残基序列与内含子预测当前 NCBI 中有关灰树花葡聚糖合成酶前，我们已重新注释了 GFGLS 的内外

氨基酸序列,葡聚糖合成酶,灰树花,系统进化树

氨基酸序列分析AMAN 软件预测 GFGLS 编码的氨基酸序列如附录 1 中所示。该开放阅读框（ORF）共编码 1781 个氨基酸，ORF 起始密码子子为 TGA。灰树花 β-1,3-葡聚糖合成酶的系统进化树构建测的灰树花β-1,3-葡聚糖合成酶蛋白序列（GFGLSp）利用NCB，比对出 GFGSLp 与拟多孔菌、云芝的 GSLp 同源性相当于较.66%和 90.38%。如图 2-2 所示，GFGLSp 与拟多孔菌 Polyporus rametes versicolor、灵芝 Ganoderma lucidum、污叉丝孔菌 Ds、虎皮香菇 Lentinus tigrinus、拟蜡菌 Obba rivulosa、密褐褶菌 Glo、高卢蜜环菌 Armillaria gallica 的 GLSp 相似性都较好。

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