转AM79-EPSPS耐除草剂基因大豆新材料的创制

发布时间：2020-07-09 18:53

【摘要】：对比国内外大豆产业的发展形势和科学研究形势,可知培育耐除草剂转基因大豆品种,已成为我国实现大豆供需平衡的有效手段。草甘膦作为高效、低毒的广谱性除草剂,一直备受青睐。AM79-EPSPS蛋白不仅具有较高的草甘膦耐受性,而且还保持着与PEP较强的亲和性,能够赋予植物对除草剂草甘膦的耐受性,是培育耐草甘膦转基因作物极佳的选择,目前尚未有在转基因大豆中应用的报导。本研究以天隆一号大豆为材料,从消毒时间、AS浓度、草甘膦浓度和蘸取IBA的时间等方面,探究并建立了高效的转AM79-EPSPS耐除草剂基因大豆转化体系。明确了当种子消毒时间为6-8小时,AS浓度为200μM/L,草甘膦浓度为1OOμM/L,蘸取IBA的时间为30s时,转化效果最好。根据该转化体系开展了一批转化并获得6株阳性苗,采用ELISA技术筛选出了表达量最高的2个植株A6和A8。针对这两个株系,采用RT-PCR技术证明了其后代不同时期不同组织中AM79-EPSPS均有表达;通过Western blot证明了外源目的蛋白在其后代组织中能够正常表达;通过Southern blot验证了目的基因AM79-EPSPS以单拷贝的形式插入A6,A8基因组,且不同世代间整合稳定。本研究还对AM79-EPSPS蛋白特征进行了分析,其与已知的对人和哺乳动物有毒性的过敏原、毒蛋白或抗营养因子无序列相似性,推测其不具有潜在的致敏性、毒性和抗营养作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.1
【图文】：

序列,载体,图谱

图２．１所示），该载体只含有一个目的基因」Ｍ７９－五尸５７５基因表达盒，不含标记逡逑基因和报告基因，ＳＰ序列为叶绿体信号肽序列，来源于豌豆（ＰｆｓｗｍｓａｆｔＶｗｗＬ．）。逡逑载体骨架载体来源于ＰＣＡＭＢＩＡ３３０１，在国际上已使用多年，没有致病性也不可逡逑能演变为有致病性。逡逑Ｈｉｎｄｌｌｌ邋（２）邋ＰｓｔＩ邋（５４８）逡逑Ｔ－Ｂｏｒｄｅｒ邋（ｌｅｆｔ）邋／逦／逡逑．一＿邋／ｓｐ／邋ＢａｍＨＩ（７２５）逡逑ＫａｎａｍｙＣｉ＾｜＾逦Ｉ邋Ｓｍａｌ（１２１０）逡逑ｉ＾＾＾ＣａＡｎ＇３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｏｒ逦ＳｍａＩ邋（１２６？）逡逑ｐＢＲ３２２邋ｏｒｉ邋N逦ａｍ７９邋ｅｐｓｐｓｐ逦ＳｍａＩ邋（１８８５）逡逑ａｍ７９－ｐＣ３３０１逦ＳａｃＩ邋（２１０４）逡逑ｐＢＲ３２２邋ｂｏｍ逦ｎｏｓ邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ逦＾＾邋ＢｓｔＥＩＩ邋（２１０Ｓ）逡逑＼逦８７４５ｂｐ逡逑Ｖ逦ｊ邋Ｔ－ｂｏｒｄｅｒ邋（ｒｉｇｈｔ）逡逑ＰＶＳ１逦／逡逑ＰＶＳ１邋ｓｔａ逡逑图２．１逦ＡＭ７９－ｐＣ３３０１载体图谱逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｃａｒｒｉｅｒ邋Ｍａｐ邋ｏｆ邋ＡＭ７９－ｐＣ３３０１逡逑２．１．３实验所用试剂逡逑无水乙醇，二甲基亚枫，ＮａＣｌ，邋Ｎａ２ＥＤＴＡ，邋ＮａＯＨ，邋ＫＣ１，邋ＥＤＴＡ，邋ＮａＣＩＯ，逡逑甘油，异丙醇，氯仿，ＭＩＸ，盐酸，硝酸钾，硝酸铵，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，逡逑无水氯化钙，硫酸锰，硫酸锌，碘化钾，硼酸，氯化钴，硫酸铜，钼酸钠，硫酸逡逑亚铁，ＶＢ１，ＶＢ６，烟酸，肌醇，琼脂粉（生工生物工程有限公司）；胰蛋白胨逡逑（ＯＸＯＩＤ）；酵母提取物（ＯＸＯＩＤ）

大豆苗,质粒,草甘膦,转基因大豆

根据转化载体Ｔ－ＤＮＡ区域序列，设计了邋ＰＣＲ检测引物，上游引物位于３５Ｓ逡逑启动子内，下游引物位于目标基因区域内。通过ＰＣＲ方法检测外逡逑源基因是否插入到大豆基因组ＤＮＡ，初步分析插入片段的整合情况。由图３．１逡逑显示，事件Ａ１－Ａ９中，除Ａ１，Ａ４，Ａ５外，其余事件均能够扩增到目标片段，说明逡逑外源插入序列已经整合到这几个事件的大豆基因组中。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋Ａ１邋Ａ２邋Ａ３邋Ａ４邋Ａ５邋Ａ６邋Ａ７邋ＡＳ邋Ａ９邋Ｎ邋Ｐ邋ｂｐ逡逑：０００—．逡逑乃0邋—＾—６４５逡逑ｉ00逡逑图３．１？０１１检测图（＾１：１＾＾１＾！＇；：＾阴忭受体材料；八１－六９：转化所得大豆苗；？：质粒）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑３．２．２草甘膦抗性鉴定结果逡逑本实验的目的基因为抗草甘膦基因，通过喷施１倍中剂量浓度草甘膦对转基逡逑因植株进行初期抗性鉴定。喷施草甘膦两周后，由图３．２显示，非转基因对照大逡逑豆已经枯萎，转基因大豆幼苗能够正常生长，表现出明显的草甘膦抗性。将抗性逡逑转基因大豆幼苗移栽至人工气候区继续培养，２－３个月后，收获转基因大豆种子逡逑备用。逡逑３１逡逑

草甘膦,转基因大豆,抗性鉴定,幼苗

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