苍术、微花藤和益母草叶绿体基因组分析及分子标记预测软件开发

发布时间：2020-07-21 18:07

【摘要】：作为植物进行光合作用和能量转化的细胞器,叶绿体在维持地球生物生存和发展过程中发挥着重要的作用。近年来,随着基因测序技术的快速发展,越来越多植物的叶绿体基因组信息得以解析。目前,基于叶绿体基因组的植物精准鉴定和系统发育学研究得到了越来越多研究者的青睐,被认为是植物鉴定与发育关系研究的一种有效手段。鉴于叶绿体基因组的重要性,本研究基于二代测序技术完成了茅苍术、北苍术、白术、微花藤、益母草5种常用药用植物的叶绿体基因组测序工作,并基于获得的叶绿体基因组序列进一步分析了各物种叶绿体基因组的结构特征、叶绿体基因组的基因组成和叶绿体基因组的结构变异情况。总的来说,本研究的研究结果主要可以分为以下4个方面:1、本研究首次获得了茅苍术、北苍术和白术3个苍术属药用植物的叶绿体基因组序列,绘制了其叶绿体基因组图谱,解析了其基因组结构。在此基础上,本研究又开发了可以有效区分这三个苍术属物种的分子标记,并在15个苍术属个体中验证了本研究所开发的分子标记真实有效。2、本研究构建了一套基于二代测序reads的分子标记开发系统。该方法基于种间核苷酸多样性大、种内核苷酸多样性小、两者之间差值大和包含Poly序列少四项基本原则评估分子标记区间PCR实验验证的成功率。本研究基于该方法进行了苍术属分子标记的开发,结果发现基于该方法开发的分子标记与苍术属分子标记开发的结果相一致。结果表明,本研究构建的基于二代测序reads的分子标记开发系统具有一定的可靠性。3、本研究首次获得了茶茱萸科药用植物微花藤的叶绿体基因组序列,并分别基于叶绿体基因组的蛋白编码序列、完整核苷酸序列和ITS序列分析了微花藤及其近源物种的系统进化关系,为实现该物种的精准鉴定及其系统进化研究提供了数据支撑。结果表明微花藤与绞木目的杜仲关系相较于它与冬青目、无患子目和卫矛目的关系更为密切。4、本研究首次获得了益母草属第一个完整的叶绿体基因组。益母草叶绿体基因组的结构和基因组成具有高度的保守性,不存在类似豆科、桔梗科等科属IR区缺失、收缩或扩张的现象。通过系统发育关系分析,本研究确定了益母草在野芝麻亚科中的系统进化位置,结果表明益母草属与水苏属进化关系比较近。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567
【图文】：

序列,叶绿体基因组,测序,测序技术

图］－２近３０年来植物叶绿体基因组测序完成情况逡逑如图１－２所示，１９８６年为叶绿体基因组测序的开局之年，在这一年来自日本的逡逑研究者首次完成了烟草和地钱两种陆生植物的叶绿体基因组测序工作。在此之后２０逡逑年间的，叶绿体基因组测序研究一直不温不火。直到２００６年开始，叶绿体基因组逡逑测序工作才开始有了起色。在此后的７年间，每年释放的叶绿体基因组数据维持在逡逑２３－５７之间。值得注意的是，从２０１３年开始，叶绿体基因组测序研宄迎来了崭新的逡逑局面。自这一年开始，每年释放的叶绿体基因组数据都成倍增加。纵观叶绿体基因逡逑组测序研宄的发展史，可将近３０年来的叶绿体基因组测序工作划分为３个阶段。逡逑１９８６年－２００５年为第一个阶段，在这个阶段采用的测序技术为以双脱氧链终止法为逡逑核心的第一代测序技术。烟草、玉米等早期叶绿体全基因组序列的获得，是通过将逡逑纯化的叶绿体ＤＮＡ随机打断或酶切后克隆到载体中，再以Ｓａｎｇｅｒ法对含有叶绿体逡逑ＤＮＡ片段的克隆载体进行测序［５７］。第一代测序技术避免了分离提取叶绿体基因组逡逑测序ｒｅａｄｓ的步骤，可以获得完整的叶绿体基因组序列。但是测序效率低、成本高、逡逑且难以完成微量ＤＮＡ样品的测序工作［５８］。第一代测序技术的局限性在很大程度上逡逑限制了叶绿体基因组测序工作的开展，因此出现了维持近２０年的叶绿体基因组测逡逑

苍术属,叶绿体基因组,密码,密码子

子共有１０，９２２个。在这些密码子中，出现频率最高和最低的分别是编码异亮氨酸和逡逑半胱氨酸的密码子，分别有Ｕ５２个（１０．５５％）和１１４个（１．０４％邋）密码子（表Ｓ４）。逡逑图２－２和表Ｓ４总结了基因组中蛋白质编码基因的密码子使用情况。图２－２显示三个逡逑物种中同义密码子的相对使用度（ＲＳＣＵ）是相似的，并且ＲＳＣＵ值随着编码特定逡逑氨基酸的密码子数量的X椉佣黾印４送猓谝堵烫寤蜃榈牡鞍字时嗦肭ǎ茫模樱╁义夏冢苈胱拥牡谝唬诙偷谌辔坏模粒院糠直鹞担福常玻ィ叮常保福ズ停叮福玻埃ァｅ义辖峁砻髟诿苈胱拥谌辔淮嬖诟撸粒院康钠眯裕庵窒窒蠛推渌降刂参锸清义侠嗨频模郏梗常荨ｅ义希稿义希ィュ澹ュ渭蒎义希掊澹村危苠义希海颍帷⑵兀垮义希洛鍤W逦Ａ邋ｔｒａｃ邋ｔｙｌｏ邋ｄｅｓ邋ｃｈｉｎｅ邋ｎｓ邋ｉｓ逦Ｊ逡逑ｌａＢＢ逦ｒｐｓＳ逦ＩｍＫ－ＵＵＵ逡逑ｉ邋ｉ邋＼逦似

序列,苍术属,叶绿体基因组,序列

多态性区域通常可用于分子标记的开发，而且针对这些区域设计合适的引物操逡逑作也很简单ｌ２７，９７ｊ。本研究中我们根据三个叶绿体基因组的比对结果选择了邋１２处多逡逑态性较高的区域作为开发分子标记的候选区间（图２－６）。为了验证１２个候选分子逡逑标记区间能否正确区分三个苍术属物种中候选标记区域的变异性，我们使用１２对逡逑引物对三个物种共１５个样品ＤＮＡ邋（每个物种５个个体）进行了邋ＰＣＲ扩增谱的分析逡逑（表Ｓ１－Ｓ２）。结果表明，所有ＰＣＲ产物均具有明亮的单一条带，但只有一对引物逡逑（引物ＣＺ１１）可以成功测序，其余ＰＣＲ产物均具有ＰｏｌｙＡ／Ｔ结构，导致测序结果逡逑不稳定或测序失败。为验证引物１１的鉴定效率和稳定性，我们利用该引物对三种逡逑物种共１５个个体样品ＤＮＡ进行ＰＣＲ实验。然后对１５个ＰＣＲ产物进行测序，每逡逑个ＰＣＲ产物重复测３次。图２－７显示了邋４５个ＰＣＲ测序序列部分长度的比对结果。逡逑结果显示三个物种的序列彼此可以清楚的区分开来，茅苍术和北苍术相比具有５ｂｐ逡逑的’ＴＡＴＡＴ’插入序列，白苍术和北苍术相比具有６ｂｐ的＇ＴＣＴＴＡＣ’插入序列。更有意逡逑思的是我们发现茅苍术和白术五个样品利用引物ＣＺ１１扩增的ＰＣＲ产物的序列之间逡逑是一致的

【参考文献】