水稻OsVDAC4互作蛋白筛选及OsVDAC5启动子表达模式分析
发布时间：2020-07-22 12:12
【摘要】：电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels,VDACs)是广泛存在于线粒体上的一种孔道蛋白,可以控制代谢产物、无机盐的运输,维持内环境的稳态,并与细胞凋亡有关。本实验室前期鉴定出了8种水稻VDAC蛋白,本实验主要围绕OsVDAC4和OsVDAC5来进行,主要取得以下2个方面结果:1.将OsVDAC4全长序列连接两个诱饵蛋白载体pBT3-N和pBT3-SUC,膜蛋白酵母双杂交结果表明pBT3-SUC-OsVDAC4可用于文库筛选。从YTB幼穗cDNA文库中筛选出4个可能与OsVDAC4互作的蛋白,进一步点对点杂交实验证明只有LOC_Os02g06640.1和LOC_Os06g51220.2与OsVDAC4互作,暂命名为OsV4IP1和OsV4IP2。生物信息学分析发现OsV4IP1蛋白有14次或是22次跨膜,或是没有跨膜。OsV4IP2蛋白没有跨膜结构。OsV4IP1和OsV4IP2都定位在核上。2.对OsVDAC5的ATG上游4500 bp序列进行生物信息学分析后,将其分为4个5'部分缺失片段pB、pC、pD和pE。将4个片段分别连接双元表达载体DX2181,通过农杆菌介导得到转基因阳性植株。目前只得到了pC、pD和pE表达GFP的阳性植株。对部分植株进行荧光观察结果表明pC、pD和pE在根的厚壁组织、内皮层、中柱表达,pC和pD在叶的表皮和中柱,叶鞘的韧皮部、叶舌、叶节,颖壳,花蕊表达。在根的皮层薄壁组织,叶肉,叶鞘内部都不表达。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S511
【图文】：
图 1.2 VDAC 信号通路图(DeHart et al., 2018a)Fig 1.2 Graphical of VDAC signal pathway(DeHart et al., 2018a)DACs 的其他功能科植物中，有研究表明膜脂调节 VDAC 的功能。磷脂是 PcV节因子，并且盐浓度也对此有影响(Mlayeh et al., 2017)。酿蛋白 Por1 和 Por2 正向调节 AMPK/Snf1 催化激活，且 Ponf1 核定位的过程中也起到重要作用(Shevade et al., 2018)。分子与 yVDAC1 相比，yVDAC2 具有不同数量的钾离子和氯离子ni et al., 2018)。以粗糙脉孢菌作为研究对象，将 VDAC 的 N 末2-12porin 被组装到外膜，结果发现与野生型相比蛋白质的水平电子传递链缺陷、交替氧化酶表达以及生长速率下降(S研究表明在小鼠中，敲除 VDAC3 会导致活性氧(reactive oxyg加，改变肾脏钠的运输，导致高血压(Zou et al., 2018)。神经
中南民族大学硕士学位论文尝试构建部分 OsVDACs 的 RNAi 植株，并取得初步成功（江晨，2011）。之后对 OsVDACs 的原核、真核表达进行了研究（熊杰，2012；刘洋，2014）。并对OsVDACs 进行了亚细胞定位（钟英健，2015）。通过膜蛋白酵母双杂交技术从YTB 幼穗 cDNA 文库中筛选到了 OsVDAC3 的 3 个互作蛋白，成功得到了OsVDAC3 超表达植株（胡颖，2015）。并进一步验证了 OsVDAC3 与其互作蛋白间的互作（程英，2017）。成功得到 OsVDAC5 的 RNAi 转基因植株，并筛选得到了 7 个与 OsVDAC5(1-75aa)互作的蛋白（谌鑫，2015），将其命名为OsV5IP1-7，为了探索 OsVDAC5(1-75aa)与 OsV5IP1-7 是否真正互作，还进行了酵母双杂、pull down、BiFC 实验，实验结果显示它们之间发生了互作（李双红，2016）。OsVDAC5 互作蛋白的亚细胞定位实验显示 OsV5IP2-5 定位于线粒体，OsV5IP1、6、7 定位于细胞质（吝婷婷，2017）。
要检测诱饵蛋白载体的自激活活性。这种酵母双杂交互作。分离-泛素系统(split-ubiquitin system)是利用泛泛素蛋白的第 34-76 氨基酸）和 NubI（包含泛素蛋白征进行的。Cub 与 NubI 在自然条件下可以形成完整 突变成 NubG 之后，Cub 与 NubG 在自然条件下难以形白酵母双杂交就是基于泛素的这个特性来筛选互作蛋 Cub，待筛选的蛋白连接泛素的 NubG，当两者发生，形成完整的泛素蛋白，完整的泛素蛋白被泛素特异性A-VP16 从 NubG-Cub-LexA-VP16 复合体上切下，LexDNA 结合结构域结合到与之对应的顺式作用元件上，域，LexA-VP16 复合体启动报告基因的表达，例如 E2、HIS3 报告基因的表达可以使酵母在 SD-4 培养基苷酶，用 X-gal 进行显色反应可以显出蓝色。
本文编号：2765798
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S511
【图文】：
图 1.2 VDAC 信号通路图(DeHart et al., 2018a)Fig 1.2 Graphical of VDAC signal pathway(DeHart et al., 2018a)DACs 的其他功能科植物中，有研究表明膜脂调节 VDAC 的功能。磷脂是 PcV节因子，并且盐浓度也对此有影响(Mlayeh et al., 2017)。酿蛋白 Por1 和 Por2 正向调节 AMPK/Snf1 催化激活，且 Ponf1 核定位的过程中也起到重要作用(Shevade et al., 2018)。分子与 yVDAC1 相比，yVDAC2 具有不同数量的钾离子和氯离子ni et al., 2018)。以粗糙脉孢菌作为研究对象，将 VDAC 的 N 末2-12porin 被组装到外膜，结果发现与野生型相比蛋白质的水平电子传递链缺陷、交替氧化酶表达以及生长速率下降(S研究表明在小鼠中，敲除 VDAC3 会导致活性氧(reactive oxyg加，改变肾脏钠的运输，导致高血压(Zou et al., 2018)。神经
中南民族大学硕士学位论文尝试构建部分 OsVDACs 的 RNAi 植株，并取得初步成功（江晨，2011）。之后对 OsVDACs 的原核、真核表达进行了研究（熊杰，2012；刘洋，2014）。并对OsVDACs 进行了亚细胞定位（钟英健，2015）。通过膜蛋白酵母双杂交技术从YTB 幼穗 cDNA 文库中筛选到了 OsVDAC3 的 3 个互作蛋白，成功得到了OsVDAC3 超表达植株（胡颖，2015）。并进一步验证了 OsVDAC3 与其互作蛋白间的互作（程英，2017）。成功得到 OsVDAC5 的 RNAi 转基因植株，并筛选得到了 7 个与 OsVDAC5(1-75aa)互作的蛋白（谌鑫，2015），将其命名为OsV5IP1-7，为了探索 OsVDAC5(1-75aa)与 OsV5IP1-7 是否真正互作，还进行了酵母双杂、pull down、BiFC 实验，实验结果显示它们之间发生了互作（李双红，2016）。OsVDAC5 互作蛋白的亚细胞定位实验显示 OsV5IP2-5 定位于线粒体，OsV5IP1、6、7 定位于细胞质（吝婷婷，2017）。
要检测诱饵蛋白载体的自激活活性。这种酵母双杂交互作。分离-泛素系统(split-ubiquitin system)是利用泛泛素蛋白的第 34-76 氨基酸）和 NubI（包含泛素蛋白征进行的。Cub 与 NubI 在自然条件下可以形成完整 突变成 NubG 之后，Cub 与 NubG 在自然条件下难以形白酵母双杂交就是基于泛素的这个特性来筛选互作蛋 Cub，待筛选的蛋白连接泛素的 NubG，当两者发生，形成完整的泛素蛋白，完整的泛素蛋白被泛素特异性A-VP16 从 NubG-Cub-LexA-VP16 复合体上切下，LexDNA 结合结构域结合到与之对应的顺式作用元件上，域，LexA-VP16 复合体启动报告基因的表达，例如 E2、HIS3 报告基因的表达可以使酵母在 SD-4 培养基苷酶，用 X-gal 进行显色反应可以显出蓝色。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王宏;李刚波;张大勇;蔺经;盛宝龙;韩金龙;常有宏;;植物HD-Zip转录因子的生物学功能[J];遗传;2013年10期
本文编号：2765798
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/2765798.html
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