玉米抗旱高通量FOX文库的构建与验证

发布时间：2020-07-22 21:16

【摘要】：玉米(Zea mays)是生产食品、动物饲料、生物燃料和化工产品的原料,是世界上产量最高、最重要的作物之一,而干旱是影响作物产量和生长的主要非生物胁迫。Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system(FOX)2006年被提出,其原理是利用一定数量的cDNA在生物中异位高效表达,从而构建一个功能获得型文库批量鉴定基因的功能。细胞对渗透胁迫的应答在真核生物中是保守的,因此,筛选表达异源cDNA的酵母文库是研究干旱胁迫相关基因的高效方法。本文构建了一个玉米干旱胁迫相关cDNA酵母文库(FOX),通过利用山梨醇模拟干旱获得了候选基因,并鉴定了玉米中CBS结构域的基因家族。主要研究结果如下:(1)以陕A、B群筛选出的抗旱自交系KA105为材料,通过对RNA提取、cDNA双链合成循环数、cDNA长度分级及载体线性化等步骤进行优化构建了酵母文库。结果显示,构建的原核文库的库容达到了6.5×10~6 cfu,绝大多数插入基因的片段大小为0.75 kb~2.00 kb,平均长度大于1.00 kb,重组率95%,真核文库的库容达到了2.8×10~6 cfu。这说明构建了高质量的FOX文库。(2)筛选整个玉米抗旱FOX酵母文库,分析候选基因并利用玉米KA105自交系的转录组数据进行表达特征分析。结果显示,在2 mol/L山梨醇胁迫下极少的野生型酵母可以存活,因此以2 mol/L山梨醇从整个文库中筛选出38个非冗余的基因,这些基因涉及信号传导(9个)、转录因子(5个)、抗氧化剂(2个)、代谢(5个)、热激蛋白/分子伴侣(2个)、细胞结构(4个)、激素响应(2个)、氧化还原稳态(1个)、物质运输(1个)、假定蛋白(5个)还有两个基因通过多种途径参与抗旱。随后,对得到的38个候选酵母再次进行渗透胁迫。大多数基因可以响应干旱胁迫,有些基因在特定组织(叶或根)上调表达,编码NAC转录因子和ABA响应蛋白的基因可以在整株水平强烈的响应干旱。5个编码未知蛋白基因中的4个可以响应干旱胁迫,这说明可能有未知功能的新途径介导了玉米抗旱。(3)筛选的38个基因中有一个包含CBS结构域,因此,分析了玉米CBS基因家族,并利用B73自交系在正常和干旱胁迫下的表达谱进行表达特征分析。结果显示,鉴定了33个玉米CBS家族基因,构建了系统进化树,结合ZmCBS家族基因的保守结构域和保守基序将其分为10个亚组。正常条件下,同一亚组成员的表达既有保守性同时也出现了变异。干旱胁迫下,多个基因在特定组织上调表达,ZmCBS17在整个植株水平都可以响应干旱胁迫。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S513
【图文】：

电泳图,电泳图,方法,两管

图 2-1 3 种 RNA 提取方法电泳图 A：TRNzol 法；B：TaKaRa 试剂盒法；C：QIAGEN 试剂盒法；D：7 号 37 ℃ 温育编号代表重复Fig. 2-1 Three kinds of total RNAextraction methods revealed by agarose gel electrophoresiA: TRNzol method; B: TaKaRa Kit method; C: QIAGEN Kit method; D: Number 7 37 ℃ inc2 h; Numbers for replication.2 cDNA 双链的合成及分级提取完 RNA 首先进行反转录将 mRNA 反转录为 cDNA 单链，mRNA 仅占总%~5%，因此，根据说明书的建议添加的 RNA 模板量为 1 μg。合成单链后添加解 mRNA，更有利于长距离 PCR 合成 cDNA 双链。在配置长距离 PCR 反应先将所有体系在一个 500 μL 离心管中充分混匀，而后每管 100 μL 分装两管，保证两管的 PCR 反应保持同步。在cDNA单链合成后，以不同PCR循环数合成双链cDNA，两管各100 μL反应一反应 6 个循环，而后 4 ℃保存 170 μLPCR 反应液，剩下的 30 μL 用来探索数。每循环 2 次取出 6 μL，最终得到了 8、10、12 和 14 循环 PCR 产物。从

循环数,分级柱,液滴,产物

图 2-2 不同 PCR 循环数合成第二链 cDNA注 M：D2000 DNAmarker；1：8 循环；2：10 循环；3：12 循环；4：14 循环ig. 2-2 Synthesized second strand cDNAs with different cycles of PCR amplificatte M: D2000 DNAmarker; 1 for 8 cycle; 2 for 10 cycle; 3 for 12 cycle; 4 for 14 c选择了最佳循环数，短片段还是会大量扩增，为了去除较短的片段的 CHROMA SPINTM +TE-1000 分级柱，将双链 cDNA 依据片段长分级柱可以处理 85 μL 的 PCR 产物，产物和洗脱液可以形成 16 个液 25~40 μL，从每个液滴取 3 μL 用琼脂糖凝胶电泳检测。对于样品整个凝胶图呈现阶梯状，1~5 孔没有出现条带，第 6 孔开始有条带且有明显的产物且长度较长大于 0.50 kb，随着孔数的增加，除了有较开始出现，10 孔为分界线长片段逐渐消失，短片段大量出现，14~1。因此对于样品 1 收集了编号 6~9 液滴。

双链,样品,长度,分级柱

图 2-2 不同 PCR 循环数合成第二链 cDNA注 M：D2000 DNAmarker；1：8 循环；2：10 循环；3：12 循环；4：14 循环Fig. 2-2 Synthesized second strand cDNAs with different cycles of PCR amplificationNote M: D2000 DNAmarker; 1 for 8 cycle; 2 for 10 cycle; 3 for 12 cycle; 4 for 14 cycle即使选择了最佳循环数，短片段还是会大量扩增，为了去除较短的片段，使盒推荐的 CHROMA SPINTM +TE-1000 分级柱，将双链 cDNA 依据片段长度进。一个分级柱可以处理 85 μL 的 PCR 产物，产物和洗脱液可以形成 16 个液滴，个液滴 25~40 μL，从每个液滴取 3 μL 用琼脂糖凝胶电泳检测。对于样品 1 从图以看出整个凝胶图呈现阶梯状，1~5 孔没有出现条带，第 6 孔开始有条带且靠近，7 孔有明显的产物且长度较长大于 0.50 kb，随着孔数的增加，除了有较长的片段也开始出现，10 孔为分界线长片段逐渐消失，短片段大量出现，14~16 孔 cD全消失。因此对于样品 1 收集了编号 6~9 液滴。

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