甘蓝型油菜显性核不育纯合两型系D3AB的细胞学观察与组学分析

发布时间：2020-07-28 10:48

【摘要】：甘蓝型油菜(Brassica napus L.)作为重要的油料作物,不仅是食用油与饲料蛋白的主要来源,同时在工业上的应用也非常广泛,因此当下亟需提高油菜产量,以满足日益增长的需求。在农业生产中,杂种优势因能显著提高作物产量和改善作物品质被广泛应用,其中细胞核雄性不育因具有不育性稳定彻底、恢复源广等优点,现已成为提高水稻、玉米、油菜等作物产量的重要途径。前人研究表明,致使雄性不育的过程极其繁杂,具体涉及到雄蕊的形态建成、花粉囊中各组织分化等多形式、多过程的基因调控,具体的分子机理也尚未明确。本研究通过形态学观察和细胞学分析确定D3A花粉败育的关键时期及特点,结合高通量测序技术,对甘蓝型油菜显性核不育纯合两型系不育材料D3A和可育材料D3B进行全基因组重测序和转录组测序分析,以期在基因组水平上找到基因突变发生的位点及在转录水平上找到与不育相关的差异基因,为甘蓝型油菜显性核不育材料D3A不育基因的克隆及功能研究奠定基础,进而丰富我国油菜杂种优势利用的遗传资源,在加快核不育的定向育种和农艺性状的快速改良上具有重要意义。主要研究结果如下:1.通过体视镜对D3A和D3B不同时期花蕾的观察分析发现,D3A与D3B外观形态无明显差别,均能正常开花,且在雄蕊发育早期均表现为正常,后期D3A雄蕊退化萎缩,花粉囊不能正常开裂;不育材料D3A子房柱头发育的速度明显快于D3B。通过扫描电镜对不同时期花药的观察发现,D3A花药的早期基部开始出现皱缩,表皮细胞排列紧密。随着花蕾的发育,D3A的花粉囊壁表皮细胞逐渐萎缩,最终塌陷使药室不能正常开裂释放花粉;D3B的花粉囊始终呈现出紧致饱满的状态,花药正常开裂,同时释放出大量成熟花粉粒。最后通过石蜡切片观察发现,不育材料D3A和可育材料D3B在花蕾发育早期,都能形成花粉母细胞,但与D3B相比,D3A中的花粉母细胞结构松散,且绒毡层已开始呈现液泡化状态;进入四分体时期,不育材料D3A的花粉囊中观察到高度液泡化的绒毡层细胞,而且无四分体结构出现,表明绒毡层细胞已提前发生降解而未向分泌型转化,使四分体时期丧失了发育过程中所必需的营养物质,从而不能形成小孢子并发育为成熟的花粉粒进行释放,最终导致不育。因此认为D3A的败育可能属于绒毡层发育异常类型。2.对不育材料D3A和可育材料D3B小花蕾(直径≤1 mm)和中花蕾(直径1-2 mm)转录组测序分析发现,在D3A的小蕾与中蕾中得到374个差异表达基因,在D3B中得到1458个。在D3A与D3B的小蕾中得到679个差异表达基因,中蕾中得到1423个。结合细胞学分析的结果,获得90个在小花蕾中特异表达的差异基因,其中上调表达的基因23个,下调表达的基因67个。根据甘蓝型油菜基因组注释信息,这些基因的功能主要是参与催化活性与蛋白结合,其中包括1个与花粉母细胞减数分裂相关的基因,5个转录因子等。通过差异基因的GO功能注释和KEGG Pathway富集分析发现,共获得135个显著的GO terms和9个显著富集的Pathway,在显著富集的9条代谢通路中,Wnt信号通路、TGF-β信号通路与mRNA监测通路与育性显著关联。另外,基因BnaC02g17290D和BnaC05g01600D分别与Wnt信号通路及mRNA监测通路相关联,因此认为上述两个基因可能为调控育性的重要差异候选基因。3.对不育材料D3A和可育材料D3B进行全基因组重测序比较分析,在D3A和D3B中分别检测到2176589个和2163868个SNP变异位点,448107个和444533个InDel变异位点,118415个和117250个SV变异位点,37005个和36146个CNV变异位点。在A亚基因组各染色体上SNP及InDel变异位点呈均匀连续分布,而C亚基因组上各变异位点呈现不均匀分布,在C02、C03、C05、C07及C09等染色体中尤为显著,且在C05染色体上的连续未变异区域约占50%。在SNP变异中,转换变异数多于颠换变异数,且在D3A中的变异数略高于D3B。在InDel变异中,片段插入量略高于片段缺失,且D3A中发生插入变异的位点多于D3B。在SV变异中,发生染色体重排的变异位点数远远高于其他变异类型,且不育材料D3A中的重排数略高于可育材料D3B。CNV变异中,拷贝数缺失的发生远高于拷贝数重复,且D3A中的拷贝数缺失明显多于D3B,拷贝数的缺失可能影响到基因编码区或缩短开放读码框。上述四种变异可能改变附近基因的表达水平,从而在D3A与D3B中出现差异表达并引起不同的表型变异。提取D3A及D3B中的有义变异位点信息进行比较分析,为后期筛选育性相关分子标记提供数据参考。4.与拟南芥基因表达谱数据库进行比对,并整合全基因组重测序与转录组测序结果,共得到10个在外显子区域发生变异的差异表达基因,它们主要参与蛋白质合成过程。qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)结果表明,发生变异的10个差异表达基因中除了基因BnaA09g16280D外,余下9个基因在D3A与D3B中表达量均存在差异,因此本研究将这9个基因作为可能引起不育的候选基因。其中8个基因在不育材料D3A小花蕾中显著下调表达,这与转录组分析结果一致;但基因BnaA03g44650D的表达量在D3A小花蕾中高于D3B,这种情况可能因为与qRT-PCR相比较,转录组在检测低丰度转录物及基因表达变化方面更灵敏。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：

示意图,细胞核雄性不育,互作,衍生系

1993)及其衍生系896AB(董振生等, 1998, 1999; 王武萍等, 1992)，白菜中发现的ABl58、91-5A(张书芳等, 1990, 1994)等都属于此种类型。图1-1 双基因互作显性细胞核雄性不育“三系法”制种示意图(刘川, 2014)Fig1-1 Genetic model of hybrid seed production for digenic male sterility using ‘threelines’method

序列,实验流程,测序,文库

录组测序技术的流程(Wang et al., 2009)中，首先是提取样本的总测 RNA 种类进行分离纯化，然后将细胞中的所有转录产物文库，将 cDNA 文库中的 DNA 随机剪切为小片段，进而片段化所需的长度（或反转录后片段化），然后在 cDNA 两端加上接高通量测序仪进行双末端测序，直到获得测序平台所需的序列，对(有参考基因组)或从头组装(无参考基因组)形成全基因组范围程中所用到的双末端测序是目前各平台广泛采用的一种策略，该 DNA 或 cDNA 打断为一定长度的片断后从两端进行测序，这样获得距离已知的两条序列信息，同时相对于单端测序增加了物cal Coverage)(Ozsolak et al., 2011; Maher et al., 2009)，因此显著增的能力。在转录组测序中，双末端测序使信号可以更好地与转录如，可以更好地区别不同剪切方式(Au et al., 2010)，鉴定由染色合基因(Maher et al., 2009; Edgren et al., 2011)等。具体测序流程如

两型系,花发育,形态分析,花蕾

图 2-1 两型系 D3A和 D3B花发育的形态分析Fig. 2-1 Morphological analysis of flower development in D3A and D3B: D3A花蕾; B: D3B 花蕾; C: D3A剥去花瓣的花蕾;D: D3B 剥去花瓣的花蕾; E: D3A花; F: D3B 花 1 mm: buds of D3A; B: buds of D3B; C: buds without petals of D3A; D: buds without petals of D3B; E: flow; F: flowers of D3B. Bar = 1 mm 纯合两型系 D3A 和 D3B 雄蕊扫描电镜观察扫描电镜观察甘蓝型油菜显性纯合两型系 D3A 和 D3B 不同发育时期的，D3A 花药的早期基部开始出现皱缩，表皮细胞排列紧密，D3B 的花育（图 2-2A, D）。随着花蕾的不断伸长生长，D3A 的花粉囊壁表皮细缩，花粉囊出现塌陷，花药纵径无明显变化，而 D3B 的花粉囊壁表皮现正常，花粉囊持续变大，花药纵径也明显伸长（图 2-2B, E）。直到开放，整个发育过程中不育材料 D3A 的花粉囊逐渐干瘪萎缩，花药纵明显变化，花粉囊继续萎蔫塌陷，药室不能正常开裂释放花粉；可育

【参考文献】